La reticulación fotoinducida de proteínas no modificadas (PICUP) es un método de reticulación de proteínas mediante la irradiación con luz visible de un fotocatalizador en presencia de un aceptor de electrones y la proteína de interés. [1] La irradiación da como resultado un radical proteico altamente reactivo que forma un enlace covalente entre las cadenas laterales de aminoácidos de las proteínas que se van a unir. Los métodos de reticulación desarrollados antes de la PICUP, incluido el uso de reticulantes físicos, oxidativos y químicos, a menudo requieren más tiempo y dan como resultado subproductos proteicos. [2] Además, el rendimiento de la proteína reticulada es muy bajo debido a la multifuncionalidad de los reactivos de reticulación.
El proceso se inventó (US6613582B1) en 1999 para utilizar técnicas de reticulación de proteínas para analizar las interacciones entre polipéptidos, así como las diferencias estructurales que experimentan las proteínas en una vía catalítica . Las técnicas del siglo XX no eran suficientes para ser aplicadas para reticular cambios rápidos y transitorios de estas proteínas con un alto rendimiento. PICUP permitió una producción rápida (<1 segundo) y alta de proteínas unidas covalentemente en estrecha proximidad entre sí. [2]
La invención de PICUP por parte de Fancy y Kodadek en 1999 fue la primera vez que se pudo realizar la reticulación de proteínas en un período de tiempo tan corto (1 segundo) y sin modificar la estructura de las proteínas en cuestión. [2] Además, PICUP pudo realizarse a un pH fisiológico de 7,4, lo que abrió las puertas para otras aplicaciones de la reticulación de proteínas, como el estudio de los mecanismos bioquímicos en los que participan las proteínas en el cuerpo humano. Además, la irradiación con luz visible en PICUP es útil porque muchas biomoléculas que participan en las vías metabólicas a analizar no absorben luz con longitudes de onda por debajo del rango de la luz UV , lo que permite realizar reticulaciones sin desnaturalización. [2]
En 2001, Gal Bitan, Aleksey Lomakin y David B. Teplow aplicaron PICUP para estudiar la oligomerización de la proteína β amiloide (Aβ) , que se observa en la enfermedad de Alzheimer. [3] PICUP permitió identificar y cuantificar los oligómeros de Aβ que son metaestables debido a su capacidad de reticularse rápidamente. [3] Al acoplar PICUP con la electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecil sulfato de sodio (SDS-PAGE) , se cuantificó la distribución de oligómeros en equilibrio rápido. [3] Esta aplicación permitió el estudio de proteínas amiloidogénicas asociadas con enfermedades neurodegenerativas y abrió las puertas a posibles mecanismos terapéuticos futuros. Actualmente se sugiere que las enfermedades neurodegenerativas son el resultado de proteínas neurotóxicas, por lo que la capacidad de estudiar su distribución de oligómeros es eficaz para comprender cómo y bajo qué condiciones se forman estos oligómeros.
El mecanismo de PICUP requiere el complejo tris(bipiridil)Ru(II) , un aceptor de electrones, persulfato de amonio (APS) y cadenas laterales de aminoácidos reactivos. [2] El hexahidrato de tris(2,2′-bipiridil)diclororutenio(II), un complejo tris(bipiridil)Ru(II), inicialmente contiene un Ru 2+ . [4] Tras la irradiación de luz visible y en presencia de persulfato de amonio (APS), el Ru 2+ entra en su estado excitado y se oxida a Ru 3+ . [4] El Ru 3+ es ahora un oxidante extremadamente reactivo que solo quiere aceptar un electrón en lugar de los dos estándar. [4] La reacción puede proceder en ausencia de un aceptor de electrones, pero tendrá una eficiencia mucho menor, produciendo subproductos resultantes de la reacción del Ru(Bpy) 3 excitado con el oxígeno. [5] Como un oxidante eficaz de un solo electrón, Ru 3+ recogerá un solo electrón de los aminoácidos de las proteínas vecinas, más comúnmente triptófano y tirosina . [4] Esto produce un radical que es altamente inestable en las cadenas laterales de aminoácidos, que avanza a través de reacciones para alcanzar un estado más estable.
El electrón único desapareado en la cadena lateral reacciona con otra cadena lateral de aminoácidos de un polipéptido en las proximidades, lo que da como resultado un dímero con un enlace covalente. [4] Con la regeneración de Ru 2+ cuando Ru 3+ recoge un electrón de los aminoácidos permite la formación continua de radicales con Ru 3+ siendo oxidado por APS. [2]
En el tubo de PCR en el que se lleva a cabo la reacción, numerosos radicales proteicos inestables entran en contacto entre sí a través de una difusión simple y reaccionan tanto intramolecular como intermolecularmente para lograr un estado más estable. Los radicales proteicos monoméricos pueden alcanzar un estado de energía más bajo mediante la formación de un enlace covalente para producir un dímero y liberar un átomo de hidrógeno. [4] TENGA EN CUENTA: La imagen muestra por error la liberación de un protón y no debe usarse en esta forma (consulte también la referencia 4). Se ha contactado al creador. Este dímero recién formado también puede reaccionar con numerosos otros monómeros o dímeros a través del mismo mecanismo, creando un mayor número de oligómeros reticulados. [4] Esto permite que haya una distribución de variedad de oligómeros presentes en la mezcla.
En cada experimento, es importante determinar la concentración relativa de la proteína en cuestión, persulfato de amonio y hexahidrato de Tris(2,2′-bipiridil)diclororutenio(II) que se utilizará en el experimento de reticulación de proteínas. Experimentos anteriores han demostrado que para la proteína β amiloide (Aβ), el péptido que se supone que causa toxicidad en la enfermedad de Alzheimer , la proporción de proteína: Ru(Bpy) 3 :APS es 1:2:40. [3] Se sugiere que la proporción de Ru(Bpy) 3 y APS se mantenga en esta proporción, pero la concentración adecuada de una proteína dada puede variar. Para muchas proteínas para las que aún no se ha utilizado PICUP, encontrar las concentraciones adecuadas se puede hacer mediante prueba y error. Generalmente, las concentraciones de proteína caerían entre 10 y 50 μM, disueltas en el tampón correspondiente, muy probablemente fosfato de sodio si se prueban condiciones a pH fisiológico. Sin embargo, algunos estudios de proteína pura sugieren que la relación proteína/Ru(Bpy) 3 también debe mantenerse en 1:2. [4] Este nivel surge del hecho de que la menor cantidad de Ru(Bpy) 3 puede hacer que la muestra de proteína parezca tener más que el número real de oligómeros de orden superior, y una mayor cantidad de Ru(Bpy) 3 puede permitir subproductos de reticulación artificial.
El método general para PICUP es el siguiente:
El uso de PICUP en complejos proteicos es útil para proporcionar información catalítica y cinética sobre estas proteínas, ya que los mecanismos catalíticos son rápidos y PICUP permite una reticulación rápida y altamente eficiente de las proteínas. [5] Se demostró que algunas etiquetas de afinidad y epítopos no se ven afectadas por la reacción PICUP, lo que permite la visualización de las proteínas reticuladas. [5]
Además, PICUP permite la visualización de bandas cuantitativas de distribución de oligómeros de proteínas cuando se combina con técnicas de fraccionamiento de proteínas. Esta combinación es especialmente útil cuando se examinan los oligómeros de enfermedades neurodegenerativas, como la enfermedad de Alzheimer , la enfermedad de Parkinson y la enfermedad de Huntington , que resultan de la agregación de proteínas. [1] PICUP es extremadamente importante cuando se exploran posibles procedimientos de prevención y tratamiento para estas enfermedades, ya que es necesario investigar la propensión a la agregación de las respectivas proteínas amiloidogénicas .