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Huella proteica

La huella de proteína es un término utilizado para referirse a un método de análisis bioquímico que investiga la estructura , el ensamblaje y las interacciones de las proteínas dentro de un ensamblaje macromolecular más grande . Originalmente se acuñó en referencia al uso de proteólisis limitada para investigar los sitios de contacto dentro de un complejo anticuerpo monoclonal - antígeno proteína [1] y un año después para examinar la protección contra la escisión de radicales hidroxilo conferida por una proteína unida al ADN dentro de un complejo ADN-proteína. [2] En la huella de ADN, se prevé que la proteína deje una huella (o huella ) en un punto particular de interacción. [3] Este último método se adaptó a través del tratamiento directo de proteínas y sus complejos con radicales hidroxilo [4] [5] y se puede denotar generalmente RP-MS (para Radical Probe - Mass Spectrometry) [6] similar a la designación utilizada para la espectrometría de masas de intercambio de hidrógeno-deuterio (denominada HD-MS o HX-MS).

Huella proteica de radicales hidroxilo

La huella de proteína de radicales hidroxilo resuelta en el tiempo (HRPF) que emplea análisis de espectrometría de masas se originó y desarrolló a fines de la década de 1990 en estudios de radiólisis de sincrotrón . [7] [8] El mismo año, estos autores (Maleknia et al.) informaron sobre el uso de una fuente de descarga eléctrica para efectuar la oxidación de proteínas en escalas de tiempo de milisegundos a medida que las proteínas pasan de la solución electrosprayada al espectrómetro de masas. [9] Años después, en 2005, los investigadores Hambly y Gross introdujeron un método para la oxidación de proteínas en la escala de tiempo de microsegundos utilizando fotólisis de flash láser de peróxido de hidrógeno para generar radicales hidroxilo. [10] Este método, oxidación fotoquímica rápida de proteínas (FPOP), afirmó que la huella de proteínas es más rápida de lo que cambian su pliegue [11] aunque este marco de tiempo ha sido cuestionado dado que el peróxido de hidrógeno, no presente en los estudios originales, y los radicales secundarios, reaccionan solos in situ durante decenas de milisegundos. [12] Estos enfoques se han utilizado desde entonces para determinar las estructuras de las proteínas, [13] el plegamiento de las proteínas, la dinámica de las proteínas y las interacciones proteína-proteína. [14]

A diferencia de los ácidos nucleicos, las proteínas se oxidan en lugar de escindirse en estas escalas de tiempo. El análisis de los productos por espectrometría de masas revela que las proteínas se oxidan de manera limitada (alrededor del 10-30% de la proteína total) en varias cadenas laterales de aminoácidos a lo largo de las proteínas. La tasa o nivel de oxidación en las cadenas laterales de aminoácidos reactivos (Met, Cys, Trp, Tyr, Phe, His, Pro y Leu) proporciona una medida de su accesibilidad al solvente a granel. Los mecanismos de oxidación de la cadena lateral se exploraron realizando las reacciones de radiólisis en agua marcada con 18 O.

Producción de radicales OH

Una característica fundamental de estos experimentos es la necesidad de exponer las proteínas a radicales hidroxilo durante escalas de tiempo limitadas del orden de 1 a 50 ms, lo que induce una oxidación del 10 al 30 % de la proteína total. Otro requisito es generar radicales hidroxilo a partir del disolvente a granel (es decir, agua) (ecuaciones 1 y 2), no peróxido de hidrógeno, que puede permanecer oxidando las proteínas incluso sin otros estímulos. [15]

H 2 O → H 2 O +• + e − + H 2 O *
H2O + • + H2O → H3O + + OH •​

Los radicales hidroxilo se pueden producir en solución mediante una descarga eléctrica dentro de una fuente de ionización por electrospray (ESI) a presión atmosférica convencional. Cuando se mantiene una diferencia de voltaje alta (~8 keV) entre una aguja de electrospray y un orificio de muestreo del analizador de masas, se pueden producir radicales en solución en la punta de la aguja de electrospray. Este método fue el primero empleado para aplicar la huella de proteínas al estudio de un complejo proteico. [16]

Método

La exposición de las proteínas a un haz de rayos X "blancos" de luz de sincrotrón o a una descarga eléctrica durante decenas de milisegundos proporciona una modificación oxidativa suficiente a las cadenas laterales de aminoácidos de la superficie sin dañar la estructura de la proteína. Estos productos se pueden detectar y cuantificar fácilmente mediante espectrometría de masas. Al ajustar el tiempo de radiólisis o los iones de proteína que pasan en la fuente de descarga, es posible un enfoque de resolución temporal que es valioso para el estudio de la dinámica de las proteínas.

Análisis

También se ha escrito un programa informático (PROXIMO) para ayudar a modelar complejos proteicos utilizando datos del método RP-MS/huella proteica. [17] Los estudios RP-MS/huella proteica de complejos proteicos también pueden emplear métodos computacionales para ayudar con este modelado. [18]

Aplicaciones

La aplicación de la espectrometría de masas por movilidad iónica ha demostrado de manera concluyente que las condiciones empleadas en los experimentos de RP-MS/huella proteica no alteran la estructura de las proteínas. [19]

Otros estudios han ampliado el método para estudiar el daño proteico de aparición temprana dada la base radical del método y la importancia de los radicales basados ​​en oxígeno en la patogénesis de muchas enfermedades, incluidos los trastornos neurológicos e incluso la ceguera. [20]

Véase también

Referencias

  1. ^ Sheshberadaran H, Payne LG (enero de 1988). "Sitios de contacto antígeno-anticuerpo monoclonal de proteína investigados mediante proteólisis limitada de antígeno unido a anticuerpo monoclonal: "huella" proteica". Actas de la Academia Nacional de Ciencias de los Estados Unidos de América . 85 (1): 1–5. Bibcode :1988PNAS...85....1S. doi : 10.1073/pnas.85.1.1 . PMC  279469 . PMID  2448767.
  2. ^ Shafer GE, Price MA, Tullius TD (1989). "Uso del radical hidroxilo y electroforesis en gel para estudiar la estructura del ADN". Electroforesis . 10 (5–6): 397–404. doi :10.1002/elps.1150100518. PMID  2504579. S2CID  38355953.
  3. ^ Galas DJ (noviembre de 2001). "La invención de la huella de carbono". Tendencias en ciencias bioquímicas . 26 (11): 690–3. doi :10.1016/S0968-0004(01)01979-X. PMID  11701330.
  4. ^ Maleknia SD, Downard KM (mayo de 2014). "Avances en espectrometría de masas con sonda radical para la identificación de huellas de proteínas en aplicaciones de biología química". Chemical Society Reviews . 43 (10): 3244–58. doi :10.1039/C3CS60432B. PMID  24590115.
  5. ^ Wang L, Chance MR (octubre de 2011). "Espectrometría de masas estructural de proteínas utilizando huellas de proteínas basadas en radicales hidroxilo". Química analítica . 83 (19): 7234–41. doi :10.1021/ac200567u. PMC 3184339 . PMID  21770468. 
  6. ^ Downard KM, Maleknia SD (2019). "Espectrometría de masas en proteómica estructural: el caso de la huella de proteínas de sonda radical". Tendencias en química analítica . 110 : 293–302. doi :10.1016/j.trac.2018.11.016.
  7. ^ Maleknia SD, Brenowitz M, Chance MR (septiembre de 1999). "Modificación radiolítica de milisegundos de péptidos mediante rayos X de sincrotrón identificados por espectrometría de masas". Química analítica . 71 (18): 3965–73. doi :10.1021/ac990500e. PMID  10500483.
  8. ^ Maleknia SD, Ralston CY, Brenowitz MD, Downard KM, Chance MR (febrero de 2001). "Determinación del plegamiento y la estructura macromolecular mediante técnicas de radiólisis de rayos X de sincrotrón". Analytical Biochemistry . 289 (2): 103–15. doi :10.1006/abio.2000.4910. PMID  11161303.
  9. ^ Maleknia SD, Chance MR, Downard KM (1999). "Modificación de proteínas asistida por electrospray: una sonda radical de la estructura de las proteínas". Comunicaciones rápidas en espectrometría de masas . 13 (23): 2352–8. Bibcode :1999RCMS...13.2352M. doi :10.1002/(SICI)1097-0231(19991215)13:23<2352::AID-RCM798>3.0.CO;2-X. PMID  10567934.
  10. ^ Hambly DM, Gross ML (diciembre de 2005). "Fotólisis con flash láser de peróxido de hidrógeno para oxidar residuos de proteínas accesibles al solvente en la escala de tiempo de microsegundos". Journal of the American Society for Mass Spectrometry . 16 (12): 2057–63. Bibcode :2005JASMS..16.2057H. doi : 10.1016/j.jasms.2005.09.008 . PMID  16263307. S2CID  24995091.
  11. ^ Gau BC, Sharp JS, Rempel DL, Gross ML (agosto de 2009). "La oxidación fotoquímica rápida de las huellas de proteínas es más rápida que el desdoblamiento de las proteínas". Química analítica . 81 (16): 6563–71. doi :10.1021/ac901054w. PMC 3164994 . PMID  20337372. 
  12. ^ Vahidi S, Konermann L (2016). "Investigación de la escala temporal de la FPOP (oxidación fotoquímica rápida de proteínas): las reacciones radicales se extienden a lo largo de decenas de milisegundos". Revista de la Sociedad Americana de Espectrometría de Masas . 27 (7): 1156–1164. Bibcode :2016JASMS..27.1156V. doi :10.1007/s13361-016-1389-x. PMID  27067899. S2CID  35039048.
  13. ^ Maleknia SD, Kiselar JG, Downard KM (2002). "Sonda de radicales hidroxilo de la superficie de la lisozima mediante radiólisis de sincrotrón y espectrometría de masas". Comunicaciones rápidas en espectrometría de masas . 16 (1): 53–61. Bibcode :2002RCMS...16...53M. doi :10.1002/rcm.543. PMID  11754247.
  14. ^ Maleknia SD, Downard K (2001). "Enfoques radicales para investigar la estructura, el plegamiento y las interacciones de las proteínas mediante espectrometría de masas". Mass Spectrometry Reviews . 20 (6): 388–401. Bibcode :2001MSRv...20..388M. doi :10.1002/mas.10013. PMID  11997945.
  15. ^ Downard K (24 de agosto de 2007). Espectrometría de masas de interacciones proteínicas. John Wiley & Sons . ISBN 978-0-470-14632-3. Recuperado el 14 de septiembre de 2013 .
  16. ^ Wong JW, Maleknia SD, Downard KM (abril de 2003). "Estudio del complejo ribonucleasa-proteína S-péptido utilizando una sonda de radicales y espectrometría de masas de ionización por electrospray". Química analítica . 75 (7): 1557–63. doi :10.1021/ac026400h. PMID  12705585.
  17. ^ Gerega SK, Downard KM (julio de 2006). "PROXIMO: un nuevo algoritmo de acoplamiento para modelar complejos proteicos utilizando datos de espectrometría de masas con sonda radical (RP-MS)". Bioinformática . 22 (14): 1702–9. doi : 10.1093/bioinformatics/btl178 . PMID  16679333.
  18. ^ Downard KM, Kokabu Y, Ikeguchi M, Akashi S (noviembre de 2011). "Estructura modelada por homología del heterodímero de βB2B3-cristalina estudiada por movilidad iónica y espectrometría de masas con sonda radical". The FEBS Journal . 278 (21): 4044–54. doi : 10.1111/j.1742-4658.2011.08309.x . PMID  21848669.
  19. ^ Downard KM, Maleknia SD, Akashi S (febrero de 2012). "Impacto de la oxidación limitada en la movilidad y la estructura de los iones de proteínas de importancia para la determinación de la huella mediante espectrometría de masas con sonda radical". Comunicaciones rápidas en espectrometría de masas . 26 (3): 226–30. Bibcode :2012RCMS...26..226D. doi :10.1002/rcm.5320. PMID  22223306.
  20. ^ Shum WK, Maleknia SD, Downard KM (septiembre de 2005). "Inicio del daño oxidativo en la alfa-cristalina mediante espectrometría de masas con sonda radical". Analytical Biochemistry . 344 (2): 247–56. doi :10.1016/j.ab.2005.06.035. PMID  16091281.