La expresión heteróloga se refiere a la expresión de un gen o parte de un gen en un organismo huésped que no tiene naturalmente el gen o fragmento de gen en cuestión. La inserción del gen en el huésped heterólogo se realiza mediante tecnología de ADN recombinante . El propósito de la expresión heteróloga suele ser determinar los efectos de las mutaciones y las interacciones diferenciales sobre la función de las proteínas. Proporciona un camino fácil para expresar y experimentar de manera eficiente con combinaciones de genes y mutantes que no ocurren naturalmente.
Dependiendo de la duración de la recombinación en el genoma del huésped, hay dos tipos de expresión heteróloga disponibles, a largo plazo (estable) y a corto plazo (transitoria). A largo plazo es una integración potencialmente permanente en el gen y a corto plazo es una modificación temporal que dura de 1 a 3 días. [1]
Después de ser insertado en el huésped, el gen puede integrarse en el ADN del huésped , provocando una expresión permanente, o no integrarse, provocando una expresión transitoria . La expresión heteróloga se puede realizar en muchos tipos de organismos huéspedes. El organismo huésped puede ser una bacteria, una levadura, una célula de mamífero o una célula vegetal. Este anfitrión se llama " sistema de expresión ". La expresión homóloga, por otro lado, se refiere a la sobreexpresión de un gen en un sistema del que se origina.
La identificación de genes se puede lograr utilizando métodos informáticos conocidos como técnicas de detección heteróloga. [2] Una biblioteca digital de secuencias de ADNc tiene datos de muchos proyectos de secuenciación y permite un fácil acceso a la información de secuencia de genes conocidos.
Si una secuencia genómica se desconoce o no está disponible, el ADN se somete a un proceso de fragmentación aleatoria, clonación y detección para determinar su fenotipo. [3] Aunque se pueden utilizar varios métodos para obtener un gen en particular, la forma más fácil de revelar los componentes de una secuencia de ADN desconocida es identificando primero sus enzimas de restricción. Las enzimas de restricción son enzimas responsables de escindir el ADN en fragmentos en un sitio específico dentro de las moléculas conocido como sitios de restricción . Estas enzimas pueden ubicarse en bacterias o arqueas y se sabe que protegen el ADN de la invasión extraña de virus. Las enzimas de restricción son distintas y cada una reconoce sólo una secuencia específica de pares de bases dentro del ADN, muchas de las cuales tienden a ser palindrómicas . Al localizar cada enzima, se puede identificar y aislar la secuencia asociada con la enzima de restricción.
Si se conoce la secuencia, se puede utilizar una técnica denominada reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para aislar un gen de interés. El propósito de la PCR no solo es identificar sino amplificar un segmento de ADN particular a través de fases de desnaturalización, hibridación y extensión. La desnaturalización coloca una plantilla de ADN de doble cadena en condiciones de alta temperatura de 95 °C para romper sus débiles enlaces de hidrógeno y forzar la separación de las cadenas. El recocido enfría la reacción para permitir que los enlaces de hidrógeno se reformen y promuevan la unión del cebador a sus secuencias complementarias en la plantilla monocatenaria de ADN. Finalmente, el paso de extensión implica que la ADN polimerasa reconozca el ADN monocatenario cebado y, por lo tanto, aísle secuencias específicas necesarias para la replicación. [3]
La entrega con pistola genética /biolística ha sido un método atractivo para la entrega de genes debido a sus propiedades no virales y, además de la transducción viral, es uno de los métodos más comunes. Esto permite respuestas inmunes menos adversas y una menor probabilidad de infección viral en comparación con los métodos de transferencia basados en virus. En lugar de utilizar un vector viral, esta técnica utiliza métodos físicos, específicamente utilizando propulsión de helio para entregar vectores de transformación. La administración de armas genéticas se ha utilizado tradicionalmente para la generación de plantas transgénicas, ya que ha podido penetrar de manera eficiente y efectiva las paredes celulares. Más recientemente, esta técnica ha tenido éxito en células animales que no pueden tolerar un bombardeo de alto nivel, donde en cambio las partículas de oro del ADN se administran a una presión de helio más baja. Este método se ha utilizado con éxito tanto in vitro como in vivo. [4]
La electroporación es un método que utiliza alto voltaje para crear poros en las membranas de las células de los mamíferos. Al pulsar con electricidad, áreas locales de la membrana celular se desestabilizan transitoriamente y el ADN puede luego ingresar a la célula. Con intensidades de campo adecuadas, el daño a la célula huésped es mínimo. [5] Esta técnica se puede utilizar para transfectantes tanto a corto como a largo plazo. [6] También es eficaz con casi cualquier tipo de tejido y ha mostrado altos niveles de entrega de genes con un aumento en la distribución de células que expresan el ADN. [5]
La transducción viral es un método que utiliza vectores virales y se utiliza para la introducción estable de genes en las células diana. En este método, el vector viral (virión) infecta las células huésped que transportan directamente el ADN al núcleo de la célula. Dos tipos comunes de virus utilizados para la transducción son los adenovirus, que tienden a ser transitorios, y los lentivirus, que integran el ADN en el genoma. Los vectores lentivirales también han sido una herramienta viral atractiva porque pueden transducir en células que no se dividen, lo que permite una transferencia estable en una amplia gama de tipos de células huésped. [7]
En la lipofección , el gen se inyecta con la ayuda de liposomas . La secuencia de ADN está encapsulada en un liposoma con la misma composición que la membrana celular. Este método le permite fusionarse directamente con la membrana o ser endocitado, lo que luego libera el ADN en la célula. La lipofección se utiliza a menudo porque funciona con muchos tipos de células diferentes, es altamente reproducible y es un método rápido para la expresión tanto estable como transitoria. [8]
Los genes se someten a menudo a expresión heteróloga para estudiar interacciones de proteínas específicas. E. coli , levadura ( S. cerevisiae , P. pastoris ), células de mamíferos inmortalizadas y ovocitos de anfibios (es decir, óvulos no fertilizados) suelen utilizarse en estudios que requieren expresión heteróloga. [9] Al elegir un sistema particular, se deben considerar aspectos económicos y cualitativos. La expresión procariótica se usa ampliamente en la tecnología del ADN recombinante para formar proteínas fácilmente manipulables mediante métodos genéticos bien conocidos con un medio de bajo costo. [10] Algunas limitaciones incluyen la acumulación intracelular de proteínas heterólogas, el plegamiento inadecuado del péptido, la falta de modificaciones postranscripcionales, la posibilidad de degradación del producto debido a trazas de impurezas de proteasa y la producción de endotoxina.
Los sistemas procarióticos y eucariotas, más comúnmente bacterias, levaduras, insectos y células de mamíferos, y ocasionalmente anfibios, hongos y protistas, se utilizan para estudios que requieren expresión heteróloga. Se han utilizado bacterias, especialmente E. coli, levaduras (S. cerevisiae, P. pastoris), insectos y células de anfibios (ovocitos) como huéspedes eficaces para expresar proteínas extrañas. En general, es más fácil trabajar con los procariotas y comprenderlos mejor y, a menudo, son el sistema huésped preferible. Se utiliza ampliamente en la tecnología del ADN recombinante para formar proteínas fácilmente manipulables mediante métodos genéticos bien conocidos con un medio de bajo costo. Sin embargo, en el caso de las proteínas de membrana, los investigadores han observado que las células de mamíferos son más eficaces. Esto se debe a que faltan modificaciones postranscripcionales en los sistemas procarióticos. Las limitaciones incluyen la acumulación intracelular de proteínas heterólogas, el plegamiento inadecuado del péptido, la posibilidad de degradación del producto debido a trazas de impurezas de proteasa y la producción de endotoxina.
Un sistema popular utilizado es Escherichia coli debido a su rápida tasa de crecimiento (~20 a 30 minutos), capacidad de fermentación continua y costo relativamente bajo. [9] Además, la levadura tiene la capacidad de expresar un alto volumen relativo de proteína heteróloga. Específicamente, hasta el 30% de las proteínas producidas en la levadura pueden ser productos génicos heterólogos. También existen cepas seguras de E. coli que se han generado con éxito para aumentar la producción. Además de las atractivas propiedades de huésped de E. coli, este huésped es increíblemente popular debido a que los investigadores tienen un gran conocimiento sobre su genética, incluida la secuencia genómica completa. Sin embargo, surgen problemas debido a la secuencia del gen de interés y aquellos que se deben a las limitaciones de E. coli como huésped. Por ejemplo, las proteínas expresadas en grandes cantidades en E. coli tienden a precipitar y agregarse, lo que luego requiere otro método de recuperación de desnaturalización y renaturalización. Finalmente, E. coli sólo es óptimamente eficaz en condiciones específicas que dependen del gen que se inserta.
Bacillus subtilis (B. subtilis) es un organismo grampositivo no patógeno que no produce lipopolisacáridos (LPS). Se sabe que el LPS, que se encuentra en las bacterias gramnegativas, causa muchos trastornos degenerativos en humanos y animales y afecta la producción de proteínas en E. coli. Por lo tanto, aunque se considera potencialmente segura, la FDA no ha clasificado oficialmente a B. subtilis como considerada generalmente segura (GRAS). B. subtilis tiene características genéticas que lo transforman fácilmente con bacteriófagos y plásmidos . [11] Además, puede facilitar más pasos de purificación mediante la secreción directa en el medio de cultivo y puede ampliarse fácilmente debido a su capacidad para secretar estas proteínas de forma no específica. Hasta la fecha, B. subtilis se ha utilizado para estudiar con éxito diferentes mecanismos biológicos, incluidos el metabolismo, la regulación genética, la diferenciación y la expresión de proteínas y la generación de productos bioactivos. También es la bacteria grampositiva mejor estudiada del mundo y la información genómica está ampliamente disponible. Los inconvenientes de este sistema huésped incluyen la expresión reducida o nula de la proteína de interés y la producción de proteasas extracelulares degradativas que se dirigen a proteínas heterólogas. Finalmente, a pesar de las atractivas propiedades de B. subtilis, estas limitaciones hacen que E.coli sea el sistema huésped predeterminado sobre B. subtilis. Sin embargo, con más investigación y optimización, B. subtilis tiene el potencial de producir proteínas de membrana a gran escala. [12]
Las células eucariotas se pueden utilizar como alternativa a la expresión procariótica de proteínas destinadas a uso terapéutico. La levadura es un hongo unicelular que utiliza altos niveles de expresión, crecimiento rápido y mantenimiento económico, similar a los sistemas procarióticos. Como la levadura es un organismo alimentario, también es favorable para la producción de productos farmacéuticos, a diferencia de E. coli, que puede contener toxinas. La levadura también tiene una tasa de crecimiento relativamente rápida, con un tiempo de duplicación de 90 minutos en medios simples, y se manipula fácilmente. Al igual que E. coli, la levadura también tiene disponible la secuencia genómica completa. La levadura más utilizada es S. cerevisiae, que puede realizar modificaciones postraduccionales como el procesamiento y el plegamiento de proteínas. S. cerevisiae , P. pastoris son organismos eucariotas simples que crecen rápidamente y son muy adaptables. [13] Los sistemas eucariotas tienen aplicaciones humanas y produjeron con éxito vacunas para la hepatitis B y el hantavirus . Hay un aumento progresivo en el uso de células de mamíferos para tecnología recombinante y síntesis de actividad biológica completa. Este sistema secreta y glicosila proteínas, al tiempo que introduce un plegamiento adecuado de proteínas y modificaciones postraduccionales. Sin embargo, cuando se emplean capacidades de glicosilación aumentadas, a menudo se observa hipermanosilación o la adición de una gran cantidad de manosa. Esto dificulta el plegamiento adecuado de las proteínas. En general, la levadura es un compromiso entre las células bacterianas y de mamíferos, y sigue siendo un sistema huésped popular. El costo de producción cuando se utiliza levadura como sistema de expresión es alto debido al lento crecimiento y al costoso requerimiento de nutrientes.
Los baculovirus son virus que infectan a los insectos y han surgido como un sistema de expresión heteróloga en eucariotas: el insecto. Como eucariota, tienen varias funciones importantes que no están presentes en los sistemas bacteriano y de levadura, incluida la modificación, el procesamiento y el sistema de transporte de proteínas. Debido a que pueden propagarse en concentraciones muy altas, se simplifica el proceso de obtención de grandes cantidades de proteínas recombinantes. Además, los investigadores descubrieron que las proteínas expresadas suelen estar localizadas en sus respectivos compartimentos y son fáciles de recolectar. Estos genomas también tienden a ser muy grandes y pueden incorporar fragmentos más grandes en comparación con los sistemas procarióticos, y tampoco son infecciosos para los vertebrados y las células de mamíferos. Sin embargo, estos vectores baculovirales están sujetos a limitaciones. Debido a que estos virus infectan de forma nativa a los invertebrados, podría haber diferencias en el procesamiento de proteínas de los vertebrados que causen algunas modificaciones dañinas. [14]
El ovocito no fertilizado de una rana, o Xenopus laevis, también se ha utilizado como sistema de expresión para la expresión heteróloga. [15] Inicialmente utilizado para expresar el receptor de acetilcolina en 1982, desde entonces se ha utilizado por diversas razones. Estos ovocitos son producidos por las ranas durante todo el año y, por lo tanto, son relativamente abundantes y la traducción se produce con alta fidelidad. De las muchas limitaciones del sistema de ovocitos, una de las principales es que las proteínas heterólogas producidas interactúan con las proteínas del ovocito de rana, lo que cambia su comportamiento en comparación con lo que sería en una célula de mamífero. Además, cuando los mamíferos son diploides, estos xenopus tienen cuatro copias homólogas de cada cromosoma y, por tanto, las proteínas derivadas pueden tener una función diferente. Se necesita más investigación para examinar la producción de proteínas de los sistemas X. laevis.
Aunque las células de mamíferos se cultivan con más dificultad, requieren más tiempo, requieren más nutrientes y son significativamente más costosas, una proteína que requiere modificaciones postraduccionales debe expresarse en células de mamíferos para proteger la eficacia clínica y la fidelidad del producto. Sin embargo, incluso entre células de mamíferos se observan diferencias, por ejemplo diferencias en la glicosilación entre células de roedores y humanas. Incluso dentro de una línea celular, la estabilización de una línea celular a menudo da como resultado patrones de glicosilación modificados. La única forma comercialmente viable de utilizar células de mamíferos como sistemas huéspedes es un producto final de alto valor. Las líneas celulares de mamíferos comunes, especialmente en investigación, incluyen la COS-7 del mono Cercopithecus aethiops, el CHO del hámster Cricetulus griseus y la línea de riñón humano HEK293. [3]
Un sistema de expresión eucariota protista común es el moho limoso, Dictyostelium discoideum, y es único porque tiene un plásmido circular, empaquetado de manera similar a la cromatina. [16] Como organismo haploide eucariota simple, puede crecer en altas concentraciones sin las costosas condiciones del cultivo de células de mamíferos y realizar modificaciones postraduccionales. La proteína en sí se expresa en varias formas, incluida la adherida a una membrana, secretada o asociada a una célula, y puede glicosilar el producto proteico.
Los hongos son descomponedores naturales de muchos ecosistemas. Como resultado, es capaz de secretar grandes cantidades de enzimas, más que los sistemas bacterianos. Sin embargo, la utilización de hongos como sistemas de expresión ha enfrentado varias barreras, especialmente debido a la falta de conocimiento sobre la genética de los hongos debido a su complejidad inherente. Los hongos filamentosos específicamente han sido un sistema huésped de interés e incluyen Penicillium (de donde se derivó la penicilina), Trichoderma reesei y Aspergillus Niger. Los hongos filamentosos son eficaces en la producción de proteínas extracelulares, evitando el paso adicional de la rotura celular para extraer proteínas. Algunos también tienen condiciones de crecimiento y medios económicos. Los hongos también contienen capacidades de glucólisis y modificación que son útiles para las proteínas eucariotas. Además, también han producido con éxito proteínas relacionadas con vacunas y la FDA ha considerado GRAS a algunos hongos filamentosos. Sin embargo, el principal inconveniente de utilizar este sistema huésped es que los rendimientos son extremadamente bajos y no son económicamente viables. Además, la baja cantidad de proteína que se produce a menudo es degradada por proteasas fúngicas. Algunos enfoques para abordar esto han sido el uso de cepas deficientes en proteasa. Los investigadores también están probando diferentes métodos de alteración genética. Con una mejor comprensión de la regulación y expresión de genes de hongos, podemos esperar que los hongos filamentosos se conviertan en un sistema huésped posiblemente viable. [dieciséis]
Los investigadores suelen utilizar técnicas de expresión heteróloga para estudiar las interacciones entre proteínas. Por ejemplo, las bacterias se han optimizado en la expresión heteróloga y la biosíntesis de la nitrogenasa a través de NifEN. Esto se puede expresar y diseñar en E.coli. [17] A través de este huésped, sigue siendo extremadamente difícil expresar de forma heteróloga una metaloproteína heteromultimérica compleja como NifEN con un complemento completo de subunidades, metaloclusters y funcionalidad. La variante NifEN diseñada en este huésped bacteriano puede conservar su eficacia cofactor en sitios de unión de cofactores análogos, lo que proporciona pruebas de expresión heteróloga y fomenta la investigación futura de esta metaloenzima. Además, ha habido informes recientes sobre la utilidad de nuevos sistemas de hongos filamentosos en la producción de proteínas industriales. Las ventajas incluyen altas frecuencias de transformación, la producción de proteínas a pH neutro, baja viscosidad del caldo de fermentación debido a la selección de cepas para un formato no filamentoso y tiempos de fermentación cortos. Muchos productos genéticos humanos, como la albúmina, la IgG y la interleucina 6, se han expresado en sistemas heterólogos con distintos grados de éxito. [18] Los resultados inconsistentes han insinuado un cambio de estudios gen por gen a un enfoque de organismo completo para la modificación postraduccional. Los ovocitos se optimizan fácilmente por su gran tamaño y capacidad de traducción, que es capaz de observar respuestas celulares integradas. Esto se aplica desde estudios de moléculas individuales dentro de células individuales hasta aplicaciones de detección de fármacos de rendimiento medio. Al examinar los ovocitos para determinar la expresión del ADNc inyectado, se puede estudiar más a fondo la aplicación de la microinyección como modelo para la expresión heteróloga en términos de señalización celular, transporte, arquitectura y función de las proteínas. [15]
Se pueden incorporar clínicamente sistemas de expresión heteróloga para evaluar la actividad enzimática en condiciones altamente reproducibles para el desarrollo de fármacos in vitro. [19] [13] Esto funciona para minimizar el riesgo del paciente al servir como una alternativa a los procedimientos altamente invasivos o la posibilidad de desarrollar reacciones adversas a los medicamentos. El análisis de la actividad enzimática requiere varios sistemas de expresión para clasificar las variantes enzimáticas. A diferencia de otros animales, la expresión de proteínas recombinantes funcionales es un proceso costoso específicamente para las células de mamíferos, debido a los bajos niveles de expresión de enzimas que contribuyen al metabolismo de los fármacos. Como resultado, los procesos de modificación postraduccional difieren entre especies y limitan las comparaciones precisas. El primer producto proteico heterólogo lanzado al mercado fue la insulina humana , más comúnmente conocida como Humulin . Este producto fue elaborado con una cepa de E. coli. La mayoría de las bacterias, incluida E. coli, no pueden secretar con éxito tales proteínas, lo que requiere pasos adicionales de recolección de células, alteración celular y aislamiento del producto antes de la purificación de proteínas.
Al igual que Humulin, ha habido muchos éxitos utilizando la expresión heteróloga para el desarrollo de fármacos. La expresión heteróloga mediante la clonación de genes que producen productos bioactivos naturales de interés también puede expresarse en sistemas huésped y ampliarse para la producción de fármacos. Por ejemplo, varios productos naturales clínicamente relevantes de los hongos son difíciles de cultivar en entornos de laboratorio. Sin embargo, después de la identificación de los grupos de genes activos correspondientes, estos genes pueden clonarse en levadura y expresarse también para producir el producto de interés de una manera más rentable y eficaz en términos de tiempo. Este método también se puede utilizar para descubrir nuevos fármacos. En este experimento se pueden caracterizar y expresar secuencias genéticas de hongos no estudiadas previamente, lo que permite la producción de nuevos productos naturales. [20] Sin embargo, con la mutagénesis de genes hacia un compuesto biológicamente más relevante, esto puede luego expresarse para producir un nuevo producto genéticamente modificado. [21]
Otro uso importante de la expresión heteróloga es detectar diferentes fármacos en un sistema huésped en lugar de en un sistema nativo más caro o difícil de mantener. Un ejemplo de esto sería el uso de Mycobacterium marinum como sistema huésped alternativo en comparación con el uso directo de Mycobacterium tuberculosis. M. tuberculosis requiere instalaciones con un alto nivel de bioseguridad para la detección de drogas y tiene una tasa de crecimiento lenta, lo que hace que el proceso sea costoso y requiera mucho tiempo. Por lo tanto, los investigadores probaron un M. marinum estrechamente relacionado y menos peligroso, cuya expresión heteróloga de dos activadores de fármacos se convirtió en un modelo preciso para probar fármacos contra la tuberculosis. [22] Un ejemplo que examina un objetivo farmacológico más específico es la expresión heteróloga del canal iónico. proteínas para probar diferentes fármacos de canales iónicos cardíacos que alteran su función para abordar las enfermedades cardíacas. [23] De manera similar, la detección de drogas puede ocurrir con la expresión heteróloga de receptores clonados. [24] Los beneficios de utilizar la expresión heteróloga aquí es que produce grandes cantidades de receptores diana de fármacos de interés y, en general, es inagotable, reproducible y económica. Estos receptores podrían luego usarse en ensayos para probar la efectividad y especificidad de la unión del fármaco. Además, los propios receptores producidos podrían utilizarse como terapia. Podrían servir como señuelos para toxinas o moléculas de señalización excesivas, y unir/atenuar estas moléculas.
La tecnología recombinante también ha desempeñado un papel en el desarrollo de biocombustibles. Esto se ha explorado utilizando sistemas de expresión que se encuentran en bacterias, plantas y levaduras. En concreto, la expresión heteróloga de enzimas celulasas utiliza celulosa , la materia prima más abundante a nivel mundial. Las enzimas celulolíticas se encuentran en plantas, insectos, bacterias y hongos y ayudan en la conversión de biomasa en biocombustible. [25] Específicamente, la celulosa se hidroliza para formar moléculas de azúcar. Por ejemplo, la manipulación de los niveles de expresión celular en enzimas celulolíticas es necesaria en huéspedes fúngicos para superar la degradación. Sin embargo, el bioprocesamiento ha resultado difícil para formar proteínas de alto rendimiento y requiere la incorporación de otras enzimas. Se pueden combinar varias cepas microbianas para expresar enzimas que dan como resultado un aumento total del rendimiento enzimático a una escala económicamente viable. [25]
El Arroz Dorado fue un OGM creado en 2005 mediante expresión heteróloga como un esfuerzo humanitario para abordar los efectos de la deficiencia de vitamina A. El arroz Oryza sativa fue transfectado con un gen para producir β-caroteno, un precursor de la vitamina A que tiene un color amarillo anaranjado. [26]
Varias limitaciones impiden la expresión heteróloga para generar productos a un nivel económicamente viable que se han observado en bacterias, levaduras y plantas. [25] En primer lugar, estos métodos siguen siendo extremadamente costosos en comparación con la producción natural, a menudo tardan más en generarse y requieren condiciones especiales para el cultivo huésped y la inducción de la expresión. Además, la mayoría de los métodos aún no se han optimizado y algunos incluso tienen una expresión más baja que la del organismo nativo. Especialmente en el caso de los genes biosintéticos para productos naturales biológicamente activos de interés, los investigadores han descubierto que se expresan muy mal en condiciones de laboratorio, especialmente debido al tamaño de los genes generalmente grandes. [27] Aunque se producen productos proteicos, a menudo se generan con un rendimiento muy bajo, se secretan poco debido a su baja solubilidad o producen otros subproductos no deseados. Los casos exitosos de producción heteróloga de productos objetivo se observan principalmente con genes de baja complejidad con una pequeña cantidad de operones. Esto a menudo se debe a la falta de coincidencia en las vías y maquinaria de inducción de expresión y regulación, y se refleja en la degradación observada de ciertas secuencias de aminoácidos, disminución de la actividad específica, transporte incorrecto de la membrana y efectos de glicosilación. Además, existen barreras durante el proceso de traducción, donde los efectos del ARNt del huésped reducen la eficiencia de la traducción, específicamente el reconocimiento por parte de los ribosomas del huésped. De manera similar, las modificaciones de las bases unidas al ARNt que difieren del sistema huésped pueden reducir la traducción de proteínas cuantitativa y cualitativamente. Por ejemplo, la traducción de un gen extraño en otro sistema huésped que no contenía el ARNt requerido resultó en una terminación temprana en el codón donde faltaba el ARNt. En conjunto, con la expresión heteróloga, cuando los sistemas de traducción del huésped son diferentes del sistema nativo desde el que se introducen los genes, son frecuentes los errores de codificación, los cambios de marco o la terminación prematura o inadecuada de la secuencia. En consecuencia, esto conduce a un menor rendimiento de proteínas funcionales o a una sobreexpresión involuntaria de la proteína. Estos errores son especialmente prominentes con el aumento significativo y antinatural de la demanda de maquinaria biológica del sistema huésped. A menudo, esto provoca la reasignación de recursos celulares de los procesos normales a la producción de la proteína heteróloga. En concreto, esto controla el suministro de ARNt y aminoácidos, los sistemas de control de calidad y los sistemas de secreción, así como el NADPH necesario para los procesos anabólicos. Además, la acumulación antinatural de proteínas heterólogas también produce efectos adversos en el huésped. [28] En general, las implicaciones no sólo son evidentes en los bajos rendimientos del producto, sino también en las respuestas al estrés del huésped y en la disminución de su viabilidad.
Hay muchas áreas de investigación activa que abordan estas limitaciones de la utilización de expresión heteróloga, especialmente en un entorno comercial. Un enfoque es determinar el sistema huésped óptimo para cada producto proteico objetivo específico, ya que las proteínas diferentes, especialmente las no nativas, a menudo tienen un comportamiento desviado en otros organismos, y algunos sistemas huéspedes pueden producir rendimientos más altos o requerir condiciones más suaves que otros. Específicamente, incorporar diferentes promotores o secuencias genéticas optimizadas y usar variantes o cepas de organismos que permitan estas modificaciones postraduccionales es un enfoque de interés. Por ejemplo, las variantes que tienen una secreción eficiente pueden permitir que la producción de productos de expresión heteróloga sea industrialmente relevante. Además, aumentar la disponibilidad de cofactores, mejorar la capacidad de plegamiento de proteínas, mejorar los promotores de genes y diseñar sistemas de control que cambien en función de las diferentes demandas de recursos. Otro enfoque es incorporar períodos transitorios en los que se reduce la producción heteróloga para permitir la recuperación del sistema huésped. Para solucionar los errores de traducción, es posible sobreexpresar el ARNt para mitigar cualquier escasez; sin embargo, las modificaciones de la base siguen dependiendo en gran medida del sistema huésped. [28] Los científicos han intentado diseñar un sistema universal para intentar mitigar estas preocupaciones, pero aún queda mucho por descubrir sobre la conexión entre los anfitriones y los productores nativos, y las implicaciones de la mayor carga sobre los sistemas anfitriones.
Los avances en la tecnología del ADN recombinante han revolucionado la idea de tratar enfermedades mediante la reconstrucción o sustitución de genes defectuosos. La terapia génica es una técnica que trasplanta genes normales a células que contienen genes faltantes o defectuosos para corregir trastornos genéticos. Sin embargo, han surgido varias preocupaciones sobre la eficacia de la terapia génica debido a su limitada tasa de éxito en los ensayos clínicos. [29] [30] A lo largo de los años, se han realizado inmensos esfuerzos para comprender completamente los vectores, los virus y su comunicación con el sistema inmunológico de su huésped. Sin embargo, no todos los sistemas de defensa reaccionan igual. Algunos pacientes han experimentado una respuesta "similar a la autoinmune" en la que su cuerpo rechaza este tratamiento. Los genes heterólogos son reconocidos como extraños para el huésped y pueden inducir respuestas inflamatorias mediadas por citoquinas que finalmente son destruidas por sus células T citotóxicas. Esto ha puesto en duda la relación entre la dosis del vector y la toxicidad celular, ya que los científicos reconocen que la activación inadecuada de estas respuestas puede causar efectos secundarios graves no sólo en las células infectadas por la enfermedad sino también en otras partes sanas del cuerpo. [29]
La modificación genética utilizada para abordar preocupaciones fuera de las necesidades médicas, como el color de ojos, las habilidades atléticas, la inteligencia, etc., es un ejemplo que ha puesto en duda la ética de su propósito. [31] La eugenesia , que coloca un grupo de características humanas deseables sobre otro, ha generado temores de una posible reacción hacia los individuos genéticamente modificados o genéticamente no modificados en la sociedad. En el caso de la edición de la línea germinal, no hay garantía de que el tratamiento proporcione una cura absoluta durante toda la vida del paciente y/o de que esos genes puedan transmitirse a su descendencia. [32] Aunque CRISPR (repeticiones palindrómicas cortas agrupadas y regularmente interespaciadas) , una técnica que permite editar genes con facilidad, puede presentar ciertos beneficios, pero también puede causar más riesgos para el cuerpo humano. Por ejemplo, puede haber limitaciones técnicas para la edición CRISPR. Hasta que se realicen avances para dotar completamente a los científicos del conocimiento necesario para comprender todos los posibles beneficios y riesgos asociados con la edición CRISPR, persisten las preocupaciones con respecto a la seguridad de sus aplicaciones. [32] La posibilidad de que la edición pueda provocar una secuencia genética incompleta o inexacta se ha informado en varios experimentos relacionados con estudios de líneas celulares tanto animales como humanas. [32] Dado que es casi imposible predecir un resultado favorable con certeza, esta técnica hace que la edición de la línea germinal sea aún más difícil de promover como cura definitiva para cualquier persona que padezca enfermedades terminales.
{{cite book}}: Mantenimiento CS1: falta el editor de la ubicación ( enlace )