El recuento de células es cualquiera de los diversos métodos para el recuento o cuantificación similar de células en las ciencias biológicas , incluido el diagnóstico y el tratamiento médicos . Es un subconjunto importante de la citometría , con aplicaciones en la investigación y la práctica clínica. Por ejemplo, el hemograma completo puede ayudar al médico a determinar por qué un paciente se siente mal y qué hacer para ayudarlo. Los recuentos de células dentro de medios líquidos (como sangre , plasma , linfa o enjuague de laboratorio) generalmente se expresan como un número de células por unidad de volumen , expresando así una concentración (por ejemplo, 5000 células por mililitro).
Numerosos procedimientos en biología y medicina requieren el recuento de células. Mediante el recuento de células en un volumen pequeño conocido , se puede mediar la concentración. Ejemplos de la necesidad de contar células incluyen:
Existen varios métodos para el recuento de células. Algunos son primitivos y no requieren equipo especial, por lo que pueden realizarse en cualquier laboratorio biológico , mientras que otros dependen de aparatos electrónicos sofisticados.
Una cámara de recuento es un portaobjetos de microscopio especialmente diseñado para permitir el recuento de células. Los hemocitómetros y las cámaras de recuento Sedgewick Rafter son dos tipos de cámaras de recuento. El hemocitómetro tiene en el centro dos cámaras reticulares, que al realizar el recuento se cubren con un portaobjetos de vidrio especial. Se coloca una gota de cultivo celular en el espacio entre la cámara y la tapa de vidrio, llenándolo por acción capilar . [1] Al observar la muestra bajo el microscopio , el investigador utiliza la cuadrícula para contar manualmente el número de células en un área determinada de tamaño conocido. La distancia de separación entre la cámara y la tapa está predefinida, de modo que se puede calcular el volumen del cultivo contado y con él la concentración de células. La viabilidad celular también se puede determinar si se añaden tintes de viabilidad al fluido.
Su ventaja es que son baratos y rápidos; esto los convierte en el método de recuento preferido en experimentos biológicos rápidos en los que sólo es necesario determinar si un cultivo celular ha crecido como se esperaba. Generalmente es necesario diluir el cultivo examinado, de lo contrario la alta densidad de células haría imposible el recuento. La necesidad de dilución es una desventaja ya que cada dilución añade inexactitud a la medición. [2]
Para cuantificar la cantidad de células en un cultivo, las células pueden simplemente colocarse en placas de Petri con medio de crecimiento . Si las células se distribuyen eficientemente en la placa, generalmente se puede suponer que cada célula dará lugar a una única colonia o Unidad Formadora de Colonias (UFC) . Luego se pueden contar las colonias y, en función del volumen conocido de cultivo que se extendió en la placa, se puede calcular la concentración celular. Esto suele realizarse siguiendo la norma ASTM D5465. [3]
Al igual que con las cámaras de recuento, los cultivos generalmente deben diluirse mucho antes de sembrarlos; de lo contrario, en lugar de obtener colonias individuales que puedan contarse, se formará el llamado "césped": miles de colonias superpuestas. Además, el cultivo en placas es el método más lento de todos: la mayoría de los microorganismos necesitan al menos 12 horas para formar colonias visibles.
Aunque este método puede llevar mucho tiempo, proporciona una estimación precisa del número de células viables (porque sólo ellas podrán crecer y formar colonias visibles). Por lo tanto, se utiliza ampliamente en experimentos destinados a cuantificar el número de células resistentes a fármacos u otras condiciones externas (por ejemplo, el experimento de Luria-Delbrück o el ensayo de protección con gentamicina ). Además, la enumeración de colonias en placas de agar puede facilitarse enormemente mediante el uso de contadores de colonias .
Un contador Coulter es un aparato que puede contar células y medir su volumen. Se basa en que las células presentan una gran resistencia eléctrica ; en otras palabras, casi no conducen electricidad . En un contador Coulter, las células, que nadan en una solución que conduce electricidad, son succionadas una por una hacia un pequeño espacio. Flanqueando la brecha hay dos electrodos que conducen electricidad. Cuando no hay ninguna celda en el espacio, la electricidad fluye sin cesar, pero cuando una celda es succionada hacia el espacio, la corriente encuentra resistencia. El contador Coulter cuenta el número de tales eventos y también mide la corriente (y por lo tanto la resistencia), que se correlaciona directamente con el volumen de la celda atrapada. Un sistema similar es la tecnología de conteo de células CASY .
Los contadores Coulter y CASY son mucho más baratos que los citómetros de flujo y, para aplicaciones que requieren números y tamaños de células, como la investigación del ciclo celular , son el método preferido. Su ventaja sobre los métodos anteriores es la gran cantidad de células que se pueden procesar en poco tiempo, es decir: miles de células por segundo. Esto ofrece una gran precisión y significación estadística .
La citometría de flujo es, con diferencia, el método más sofisticado y costoso para el recuento de células. En un citómetro de flujo, las células fluyen en una corriente estrecha delante de un rayo láser . El rayo las incide una por una y un detector de luz capta la luz reflejada por las células.
Los citómetros de flujo tienen muchas otras capacidades, como analizar la forma de las células y sus estructuras internas y externas, así como medir la cantidad de proteínas específicas y otros productos bioquímicos en las células. Por lo tanto, los citómetros de flujo rara vez se compran con el único fin de contar células. [ cita necesaria ]
Los enfoques recientes consideran el uso de imágenes de microscopía de alta calidad sobre las cuales se utiliza un algoritmo de clasificación estadística para realizar la detección y el recuento celular automatizados como una tarea de análisis de imágenes . [4] Generalmente se realiza con una tasa de error constante como un proceso de tipo fuera de línea (por lotes). Para este fin se pueden emplear una variedad de técnicas de clasificación de imágenes . [5]
En la actualidad, el recuento estereológico de células con decisión manual para la inclusión de objetos según reglas de recuento estereológico imparcial sigue siendo el único método adecuado para la cuantificación imparcial de células en secciones de tejido histológico, por lo que no es lo suficientemente adecuado como para ser completamente automatizado. [6]
Las suspensiones celulares son turbias . Las células absorben y dispersan la luz. Cuanto mayor sea la concentración de células, mayor será la turbidez. Los espectrofotómetros pueden medir la intensidad de la luz con mucha precisión. El cultivo celular se coloca en una cubeta transparente y se mide la absorción con respecto al medio solo. La densidad óptica (DO) es directamente proporcional a la biomasa en la suspensión celular en un rango determinado que es específico del tipo de célula. El uso de espectrofotometría para medir la turbidez de los cultivos se conoce como turbidometría .
Esto ha convertido a la espectrofotometría en el método de elección para medir el crecimiento bacteriano y aplicaciones relacionadas. El inconveniente de la espectrofotometría es su incapacidad para proporcionar un recuento absoluto o distinguir entre células vivas y muertas.
La microbiología de impedancia es una técnica microbiológica rápida que se utiliza para medir la concentración microbiana (principalmente bacterias pero también levaduras ) de una muestra mediante el monitoreo de los parámetros eléctricos del medio de crecimiento. Se basa en el hecho de que el metabolismo de las bacterias transforma compuestos sin carga (o débilmente cargados) en compuestos altamente cargados, cambiando así las propiedades eléctricas del medio de crecimiento . La concentración microbiana se estima en función del tiempo necesario para que los parámetros eléctricos monitoreados se desvíen del valor inicial.
Se encuentran disponibles diferentes instrumentos (ya sea construidos en un laboratorio o disponibles comercialmente) para medir la concentración bacteriana mediante Microbiología de Impedancia. [7] [8] [9] [10] [11]