Los ensayos enzimáticos son métodos de laboratorio para medir la actividad enzimática . Son vitales para el estudio de la cinética enzimática y la inhibición enzimática .
La cantidad o concentración de una enzima se puede expresar en cantidades molares , como ocurre con cualquier otra sustancia química, o en términos de actividad en unidades enzimáticas .
La actividad enzimática es una medida de la cantidad de enzima activa presente y, por tanto, depende de diversas condiciones físicas, que deben especificarse .
Se calcula mediante la siguiente fórmula:
dónde
La unidad SI es el katal , 1 katal = 1 mol s −1 (mol por segundo), pero es una unidad excesivamente grande. Un valor más práctico y comúnmente utilizado es la unidad enzimática (U) = 1 μmol min −1 (micromol por minuto). 1 U corresponde a 16,67 nanokatales . [1]
La actividad enzimática tal como se indica en katal generalmente se refiere a la del sustrato objetivo natural supuesto de la enzima. La actividad enzimática también se puede dar como la de ciertos sustratos estandarizados, como la gelatina , luego medida en unidades de digestión de gelatina (GDU), o proteínas de la leche, luego medidas en unidades de coagulación de la leche (MCU). Las unidades GDU y MCU se basan en la rapidez con la que un gramo de enzima digiere la gelatina o las proteínas de la leche, respectivamente. 1 GDU equivale aproximadamente a 1,5 MCU. [2]
Una mayor cantidad de sustrato aumentará la velocidad de reacción con las enzimas; sin embargo, una vez pasado cierto punto, la velocidad de reacción se estabilizará porque la cantidad de sitios activos disponibles se ha mantenido constante.
La actividad específica de una enzima es otra unidad común. Esta es la actividad de una enzima por miligramo de proteína total (expresada en μmol min −1 mg −1 ). La actividad específica proporciona una medida de la pureza de la enzima en la mezcla. Son los micromoles de producto formados por una enzima en un período de tiempo determinado (minutos) en condiciones determinadas por miligramo de proteínas totales. La actividad específica es igual a la velocidad de reacción multiplicada por el volumen de reacción dividido por la masa de proteína total. La unidad SI es katal/kg, pero una unidad más práctica es μmol/mgmin.
La actividad específica es una medida de la procesividad de la enzima (la capacidad de la enzima para ser procesada), a una concentración de sustrato específica (generalmente saturante) , y suele ser constante para una enzima pura.
Se puede realizar un proceso de titulación en sitio activo para eliminar errores que surgen de diferencias en los lotes de cultivo y/o enzimas mal plegadas y problemas similares. Ésta es una medida de la cantidad de enzima activa, calculada, por ejemplo, valorando la cantidad de sitios activos presentes empleando un inhibidor irreversible. Luego, la actividad específica debe expresarse como μmol min −1 mg −1 de enzima activa. Si se conoce el peso molecular de la enzima, el número de recambio , o µmol de producto por segundo por µmol de enzima activa, se puede calcular a partir de la actividad específica. El número de recambio se puede visualizar como el número de veces que cada molécula de enzima realiza su ciclo catalítico por segundo.
La velocidad de una reacción es la concentración de sustrato que desaparece (o producto producido) por unidad de tiempo (mol L −1 s −1 ).
El % de pureza es 100% × (actividad específica de la muestra de enzima/actividad específica de la enzima pura). La muestra impura tiene una actividad específica menor porque parte de la masa no es en realidad enzima. Si se conoce la actividad específica de una enzima 100% pura, entonces una muestra impura tendrá una actividad específica más baja, lo que permitirá calcular la pureza y luego obtener un resultado claro.
Todos los ensayos enzimáticos miden el consumo de sustrato o la producción de producto a lo largo del tiempo. Existe una gran cantidad de métodos diferentes para medir las concentraciones de sustratos y productos y muchas enzimas se pueden analizar de varias maneras diferentes. Los bioquímicos suelen estudiar reacciones catalizadas por enzimas mediante cuatro tipos de experimentos: [3]
Los ensayos enzimáticos se pueden dividir en dos grupos según su método de muestreo: ensayos continuos , donde el ensayo proporciona una lectura continua de la actividad, y ensayos discontinuos , donde se toman muestras, se detiene la reacción y luego se determina la concentración de sustratos/productos.
Los ensayos continuos son los más convenientes: un ensayo proporciona la velocidad de reacción sin necesidad de realizar más trabajo. Hay muchos tipos diferentes de ensayos continuos.
En los ensayos espectrofotométricos , se sigue el curso de la reacción midiendo un cambio en la cantidad de luz que absorbe la solución de ensayo. Si esta luz está en la región visible, se puede ver un cambio en el color del ensayo, y estos se denominan ensayos colorimétricos . El ensayo MTT , un ensayo redox que utiliza un tinte de tetrazolio como sustrato, es un ejemplo de ensayo colorimétrico.
A menudo se utiliza luz ultravioleta, ya que las coenzimas comunes NADH y NADPH absorben la luz ultravioleta en sus formas reducidas , pero no en sus formas oxidadas . Por lo tanto, podría analizarse una oxidorreductasa que utilice NADH como sustrato siguiendo la disminución de la absorbancia de UV a una longitud de onda de 340 nm a medida que consume la coenzima. [4]
Ensayos directos versus acoplados.
Incluso cuando la reacción enzimática no da como resultado un cambio en la absorbancia de la luz, todavía es posible utilizar un ensayo espectrofotométrico para la enzima mediante el uso de un ensayo acoplado . En este caso, el producto de una reacción se utiliza como sustrato de otra reacción fácilmente detectable. Por ejemplo, la figura 1 muestra el ensayo acoplado para la enzima hexoquinasa , que se puede analizar acoplando su producción de glucosa-6-fosfato a la producción de NADPH, utilizando glucosa-6-fosfato deshidrogenasa .
La fluorescencia es cuando una molécula emite luz de una longitud de onda después de absorber luz de una longitud de onda diferente. Los ensayos fluorométricos utilizan una diferencia en la fluorescencia del sustrato y del producto para medir la reacción enzimática. Estos ensayos son en general mucho más sensibles que los ensayos espectrofotométricos, pero pueden sufrir interferencias causadas por impurezas y la inestabilidad de muchos compuestos fluorescentes cuando se exponen a la luz.
Un ejemplo de estos ensayos es nuevamente el uso de las coenzimas de nucleótidos NADH y NADPH. En este caso, las formas reducidas son fluorescentes y las formas oxidadas no fluorescentes. Por lo tanto, las reacciones de oxidación pueden ir seguidas de una disminución de la fluorescencia y de las reacciones de reducción, de un aumento. [5] También se encuentran disponibles sustratos sintéticos que liberan un tinte fluorescente en una reacción catalizada por enzimas, como el 4-metilumbeliferil-β-D-galactósido para analizar la β-galactosidasa o el 4-metilumbeliferil-butirato para analizar la lipasa de Candida rugosa . [6]
La calorimetría es la medida del calor liberado o absorbido por reacciones químicas. Estos ensayos son muy generales, ya que muchas reacciones implican algún cambio de calor y con el uso de un microcalorímetro, no se requiere mucha enzima o sustrato. Estos ensayos se pueden utilizar para medir reacciones que son imposibles de analizar de otra manera. [7]
La quimioluminiscencia es la emisión de luz mediante una reacción química. Algunas reacciones enzimáticas producen luz y esto se puede medir para detectar la formación de productos. Estos tipos de ensayos pueden ser extremadamente sensibles, ya que la luz producida puede capturarse con una película fotográfica durante días o semanas, pero pueden ser difíciles de cuantificar porque no se detectará toda la luz liberada por una reacción.
La detección de peroxidasa de rábano picante mediante quimioluminiscencia enzimática (ECL) es un método común para detectar anticuerpos en la transferencia Western . Otro ejemplo es la enzima luciferasa , esta se encuentra en las luciérnagas y produce luz de forma natural a partir de su sustrato luciferina.
La dispersión de luz estática mide el producto de la masa molar promedio en peso y la concentración de macromoléculas en solución. Dada una concentración total fija de una o más especies durante el tiempo de medición, la señal de dispersión es una medida directa de la masa molar promedio en peso de la solución, que variará a medida que se formen o disocian los complejos. Por tanto, la medición cuantifica la estequiometría de los complejos así como la cinética. Los ensayos de dispersión de luz de la cinética de proteínas son una técnica muy general que no requiere una enzima.
La termoforesis a microescala (MST) [8] mide el tamaño, la carga y la entropía de hidratación de moléculas/sustratos en equilibrio. [9] El movimiento termoforético de un sustrato marcado con fluorescencia cambia significativamente a medida que es modificado por una enzima. Esta actividad enzimática se puede medir con alta resolución temporal en tiempo real. [10] El consumo de material del método MST totalmente óptico es muy bajo, solo se necesitan 5 μl de volumen de muestra y una concentración de enzima de 10 nM para medir las constantes de velocidad enzimática para la actividad y la inhibición. MST permite a los analistas medir la modificación de dos sustratos diferentes a la vez ( multiplexación ) si ambos sustratos están marcados con fluoróforos diferentes. De este modo se pueden realizar experimentos de competencia de sustrato.
Los ensayos discontinuos son cuando se toman muestras de una reacción enzimática a intervalos y se mide la cantidad de producción de producto o consumo de sustrato en estas muestras.
Los ensayos radiométricos miden la incorporación de radiactividad a los sustratos o su liberación de los sustratos. Los isótopos radiactivos utilizados con mayor frecuencia en estos ensayos son 14 C, 32 P, 35 S y 125 I. Dado que los isótopos radiactivos pueden permitir el marcaje específico de un solo átomo de un sustrato, estos ensayos son extremadamente sensibles y específicos. Se utilizan con frecuencia en bioquímica y, a menudo, son la única forma de medir una reacción específica en extractos crudos (las mezclas complejas de enzimas producidas cuando se lisan células).
En estos procedimientos normalmente se mide la radiactividad utilizando un contador de centelleo .
Los ensayos cromatográficos miden la formación de productos separando la mezcla de reacción en sus componentes mediante cromatografía . Esto generalmente se hace mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), pero también se puede utilizar la técnica más simple de cromatografía en capa fina . Aunque este enfoque puede necesitar una gran cantidad de material, su sensibilidad se puede aumentar etiquetando los sustratos/productos con una etiqueta radiactiva o fluorescente. La sensibilidad del ensayo también se ha incrementado al cambiar los protocolos a instrumentos cromatográficos mejorados (por ejemplo, cromatografía líquida de presión ultraalta) que funcionan a una presión de bomba unas veces mayor que los instrumentos de HPLC (consulte Cromatografía líquida de alto rendimiento#Presión de bomba ). [11]
Varios factores afectan el resultado del ensayo y una revisión reciente resume los diversos parámetros que deben monitorearse para mantener un ensayo en funcionamiento.
La mayoría de las enzimas no pueden tolerar concentraciones de sal extremadamente altas. Los iones interfieren con los enlaces iónicos débiles de las proteínas . Las enzimas típicas son activas en concentraciones de sal de 1 a 500 mM. Como es habitual, existen excepciones como las algas y bacterias halófilas .
Todas las enzimas trabajan dentro de un rango de temperatura específico del organismo. Los aumentos de temperatura generalmente conducen a aumentos en las velocidades de reacción. Hay un límite para el aumento porque las temperaturas más altas conducen a una fuerte disminución en las velocidades de reacción. Esto se debe a la desnaturalización (alteración) de la estructura de la proteína resultante de la ruptura de los enlaces iónicos y de hidrógeno débiles que estabilizan la estructura tridimensional del sitio activo de la enzima. [12] La temperatura "óptima" para las enzimas humanas suele estar entre 35 y 40 °C. La temperatura media para los seres humanos es de 37 °C. Las enzimas humanas comienzan a desnaturalizarse rápidamente a temperaturas superiores a 40 °C. Las enzimas de las arqueas termófilas que se encuentran en las aguas termales son estables hasta los 100 °C. [13] Sin embargo, la idea de una velocidad "óptima" de una reacción enzimática es engañosa, ya que la velocidad observada a cualquier temperatura es el producto de dos velocidades, la velocidad de reacción y la velocidad de desnaturalización. Si utilizara un ensayo para medir la actividad durante un segundo, obtendría una alta actividad a altas temperaturas; sin embargo, si utilizara un ensayo para medir la formación de producto durante una hora, obtendría una baja actividad a estas temperaturas.
La mayoría de las enzimas son sensibles al pH y tienen rangos de actividad específicos. Todos tienen un pH óptimo. El pH puede detener la actividad enzimática al desnaturalizar (alterar) la forma tridimensional de la enzima al romper los enlaces iónicos y de hidrógeno . La mayoría de las enzimas funcionan entre un pH de 6 y 8; sin embargo, la pepsina en el estómago funciona mejor con un pH de 2 y la tripsina con un pH de 8.
El aumento de la concentración del sustrato aumenta la velocidad de reacción (actividad enzimática). Sin embargo, la saturación de enzimas limita las velocidades de reacción. Una enzima está saturada cuando los sitios activos de todas las moléculas están ocupados la mayor parte del tiempo. En el punto de saturación, la reacción no se acelerará, sin importar cuánto sustrato adicional se agregue. La gráfica de la velocidad de reacción se estabilizará.
Grandes cantidades de macromoléculas en una solución alterarán las velocidades y las constantes de equilibrio de las reacciones enzimáticas, mediante un efecto llamado apiñamiento macromolecular . [14]
Medios relacionados con ensayos enzimáticos en Wikimedia Commons
