Transferencia de energía de resonancia de Förster

Mecanismo de transferencia de energía fotoquímica.

Diagrama de Jablonski de FRET con escalas de tiempo típicas indicadas. La línea discontinua negra indica un fotón virtual .

La transferencia de energía por resonancia de Förster ( FRET ), la transferencia de energía por resonancia de fluorescencia , la transferencia de energía por resonancia ( RET ) o la transferencia electrónica de energía ( EET ) es un mecanismo que describe la transferencia de energía entre dos moléculas sensibles a la luz ( cromóforos ). ^[1] Un cromóforo donante, inicialmente en su estado electrónico excitado, puede transferir energía a un cromóforo aceptor mediante un acoplamiento dipolo-dipolo no radiativo . ^[2] La eficiencia de esta transferencia de energía es inversamente proporcional a la sexta potencia de la distancia entre el donante y el aceptor, lo que hace que FRET sea extremadamente sensible a pequeños cambios en la distancia. ^{[3] [4]}

Se pueden utilizar mediciones de la eficiencia de FRET para determinar si dos fluoróforos están a cierta distancia uno del otro. ^[5] Estas mediciones se utilizan como herramienta de investigación en campos como la biología y la química.

FRET es análogo a la comunicación de campo cercano , en el sentido de que el radio de interacción es mucho menor que la longitud de onda de la luz emitida. En la región del campo cercano, el cromóforo excitado emite un fotón virtual que es absorbido instantáneamente por un cromóforo receptor. Estos fotones virtuales son indetectables, ya que su existencia viola la conservación de la energía y el momento, y por eso se conoce a FRET como un mecanismo sin radiación . Se han utilizado cálculos electrodinámicos cuánticos para determinar que la transferencia de energía sin radiación (FRET) y radiativa son las asíntotas de corto y largo alcance de un único mecanismo unificado. ^{[6] [7] [8]}

Terminología

Diagrama de dibujos animados del concepto de transferencia de energía por resonancia de Förster (FRET).

La transferencia de energía por resonancia de Förster lleva el nombre del científico alemán Theodor Förster . ^[9] Cuando ambos cromóforos son fluorescentes, a menudo se utiliza el término "transferencia de energía por resonancia de fluorescencia", aunque la energía en realidad no se transfiere mediante fluorescencia . ^{[10] [11]} Para evitar una interpretación errónea del fenómeno que es siempre una transferencia de energía no radiativa (incluso cuando ocurre entre dos cromóforos fluorescentes), se prefiere el nombre "transferencia de energía por resonancia de Förster" a "transferencia de energía por resonancia de fluorescencia". "; sin embargo, este último goza de un uso común en la literatura científica. ^[12] FRET no se limita a la fluorescencia y también ocurre en relación con la fosforescencia. ^[10]

Bases teóricas

La eficiencia FRET ( ) es el rendimiento cuántico de la transición de transferencia de energía, es decir, la probabilidad de que ocurra un evento de transferencia de energía por evento de excitación del donante: ^[13] ${\displaystyle E}$

${\displaystyle E={\frac {k_{\text{ET}}}{k_{f}+k_{\text{ET}}+\sum {k_{i}}}},}$

donde la tasa de desintegración radiativa del donante es la tasa de transferencia de energía y las tasas de cualquier otra vía de desexcitación, excluidas las transferencias de energía a otros aceptores. ^{[14] [15]} ${\displaystyle k_{f}}$ ${\displaystyle k_{\text{ET}}}$ ${\displaystyle k_{i}}$

La eficiencia de FRET depende de muchos parámetros físicos ^[16] que se pueden agrupar como: 1) la distancia entre el donante y el aceptor (típicamente en el rango de 1 a 10 nm), 2) la superposición espectral del espectro de emisión del donante y el espectro de absorción del aceptor , y 3) la orientación relativa del momento dipolar de emisión del donante y el momento dipolar de absorción del aceptor.

${\displaystyle E}$depende de la distancia de separación entre donante y aceptor con una ley inversa de sexta potencia debido al mecanismo de acoplamiento dipolo-dipolo: ${\displaystyle r}$

${\displaystyle E={\frac {1}{1+(r/R_{0})^{6}}}}$

siendo la distancia de Förster de este par de donante y aceptor, es decir, la distancia a la que la eficiencia de transferencia de energía es del 50%. ^[14] La distancia de Förster depende de la integral de superposición del espectro de emisión del donante con el espectro de absorción del aceptor y su orientación molecular mutua como se expresa en la siguiente ecuación, todo en unidades SI: ^{[17] [18] [19]} ${\displaystyle R_{0}}$

${\displaystyle {R_{0}}^{6}={\frac {2.07}{128\,\pi ^{5}\,N_{A}}}\,{\frac {\kappa ^{2}\,Q_{D}}{n^{4}}}J}$

donde es el rendimiento cuántico de fluorescencia del donante en ausencia del aceptor, es el factor de orientación dipolar, es el índice de refracción del medio, es la constante de Avogadro y es la integral de superposición espectral calculada como ${\displaystyle Q_{\text{D}}}$ ${\displaystyle \kappa ^{2}}$ ${\displaystyle n}$ ${\displaystyle N_{\text{A}}}$ ${\displaystyle J}$

${\displaystyle J={\frac {\int f_{\text{D}}(\lambda )\epsilon _{\text{A}}(\lambda )\lambda ^{4}\,d\lambda }{\int f_{\text{D}}(\lambda )\,d\lambda }}=\int {\overline {f_{\text{D}}}}(\lambda )\epsilon _{\text{A}}(\lambda )\lambda ^{4}\,d\lambda ,}$

donde es el espectro de emisión del donante, es el espectro de emisión del donante normalizado a un área de 1 y es el coeficiente de extinción molar del aceptor , normalmente obtenido a partir de un espectro de absorción. ^[20] El factor de orientación κ viene dado por ${\displaystyle f_{\text{D}}}$ ${\displaystyle {\overline {f_{\text{D}}}}}$ ${\displaystyle \epsilon _{\text{A}}}$

${\displaystyle \kappa ={\hat {\mu }}_{\text{A}}\cdot {\hat {\mu }}_{\text{D}}-3({\hat {\mu }}_{\text{D}}\cdot {\hat {R}})({\hat {\mu }}_{\text{A}}\cdot {\hat {R}}),}$

donde denota el momento dipolar de transición normalizado del fluoróforo respectivo y denota el desplazamiento interfluoróforo normalizado. ^{A menudo se supone [21]} = 2/3. Este valor se obtiene cuando ambos tintes giran libremente y se puede considerar que están orientados isotrópicamente durante la vida útil del estado excitado. Si alguno de los tintes está fijo o no tiene libertad para rotar, entonces = 2/3 no será una suposición válida. Sin embargo, en la mayoría de los casos, incluso una reorientación modesta de los tintes da como resultado un promedio de orientación suficiente que = 2/3 no da como resultado un gran error en la distancia estimada de transferencia de energía debido a la dependencia de sexta potencia de . Incluso cuando es bastante diferente de 2/3, el error puede estar asociado con un desplazamiento de , por lo que las determinaciones de cambios en la distancia relativa para un sistema particular siguen siendo válidas. Las proteínas fluorescentes no se reorientan en una escala de tiempo más rápida que su vida útil de fluorescencia. En este caso 0 ≤ ≤ 4. ^[20] ${\displaystyle {\hat {\mu }}_{i}}$ ${\displaystyle {\hat {R}}}$ ${\displaystyle \kappa ^{2}}$ ${\displaystyle \kappa ^{2}}$ ${\displaystyle \kappa ^{2}}$ ${\displaystyle R_{0}}$ ${\displaystyle \kappa ^{2}}$ ${\displaystyle \kappa ^{2}}$ ${\displaystyle R_{0}}$ ${\displaystyle \kappa ^{2}}$

Las unidades de los datos generalmente no están en unidades SI. Suele ser más conveniente utilizar las unidades originales para calcular la distancia de Förster. Por ejemplo, la longitud de onda suele estar en la unidad nm y el coeficiente de extinción suele estar en la unidad , donde está la concentración . obtenido de estas unidades tendrá unidad . Para usar la unidad Å ( ) para , la ecuación se ajusta a ^{[17] [22] [23] [24]} ${\displaystyle M^{-1}cm^{-1}}$ ${\displaystyle M}$ ${\displaystyle mol/L}$ ${\displaystyle J}$ ${\displaystyle M^{-1}cm^{-1}nm^{4}}$ ${\displaystyle 10^{-10}m}$ ${\displaystyle R_{0}}$

${\displaystyle {R_{0}}^{6}=8.785\times 10^{-5}{\frac {\kappa ^{2}\,Q_{D}}{n^{4}}}J}$ (A ) ${\displaystyle ^{6}}$

Para análisis de FRET dependientes del tiempo, la tasa de transferencia de energía ( ) se puede utilizar directamente en su lugar: ^[17] ${\displaystyle k_{\text{ET}}}$

${\displaystyle k_{\text{ET}}=({\frac {R_{0}}{r}})^{6}\,{\frac {1}{\tau _{D}}}}$

¿Dónde está la vida de fluorescencia del donante en ausencia del aceptor? ${\displaystyle \tau _{D}}$

La eficiencia de FRET se relaciona con el rendimiento cuántico y la vida útil de la fluorescencia de la molécula donante de la siguiente manera: ^[25]

${\displaystyle E=1-\tau '_{\text{D}}/\tau _{\text{D}},}$

donde y son las vidas de fluorescencia del donante en presencia y ausencia de un aceptor respectivamente, o como ${\displaystyle \tau _{\text{D}}'}$ ${\displaystyle \tau _{\text{D}}}$

${\displaystyle E=1-F_{\text{D}}'/F_{\text{D}},}$

donde y son las intensidades de fluorescencia del donante con y sin aceptor respectivamente. ${\displaystyle F_{\text{D}}'}$ ${\displaystyle F_{\text{D}}}$

Confirmación experimental de la teoría FRET.

La dependencia inversa de la distancia de sexta potencia de la transferencia de energía de resonancia de Förster fue confirmada experimentalmente por Wilchek , Edelhoch y Brand ^[26] utilizando péptidos triptófilos. Stryer , Haugland e Yguerabide ^{[27] [ cita necesaria ] [28]} también demostraron experimentalmente la dependencia teórica de la transferencia de energía de resonancia de Förster en la integral de superposición mediante el uso de un indoloesteroide fusionado como donante y una cetona como aceptor. Los cálculos sobre las distancias FRET de algunos pares de tintes de ejemplo se pueden encontrar aquí. ^{[22] [24]} Sin embargo, se observaron muchas contradicciones en experimentos especiales con la teoría en entornos complicados cuando las orientaciones y los rendimientos cuánticos de las moléculas son difíciles de estimar. ^[29]

Métodos para medir la eficiencia de FRET

En microscopía de fluorescencia , microscopía de barrido láser confocal de fluorescencia , así como en biología molecular , FRET es una herramienta útil para cuantificar la dinámica molecular en biofísica y bioquímica , como las interacciones proteína -proteína, las interacciones proteína- ADN y los cambios conformacionales de las proteínas. Para controlar la formación de complejos entre dos moléculas, una de ellas se marca con un donante y la otra con un aceptor. La eficiencia de FRET se mide y se utiliza para identificar interacciones entre los complejos marcados. Hay varias formas de medir la eficiencia de FRET monitorizando los cambios en la fluorescencia emitida por el donante o el aceptor. ^[30]

Emisión sensibilizada

Un método para medir la eficiencia de FRET es medir la variación en la intensidad de emisión del aceptor. ^[18] Cuando el donante y el aceptor están cerca (1–10 nm) debido a la interacción de las dos moléculas, la emisión del aceptor aumentará debido a la FRET intermolecular del donante al aceptor. Para monitorear los cambios conformacionales de las proteínas, la proteína objetivo se marca con un donante y un aceptor en dos loci. Cuando una torsión o curvatura de la proteína produce un cambio en la distancia u orientación relativa del donante y el aceptor, se observa un cambio FRET. Si una interacción molecular o un cambio conformacional de una proteína depende de la unión del ligando , esta técnica FRET es aplicable a indicadores fluorescentes para la detección del ligando.

Fotoblanqueo FRET

Las eficiencias de FRET también se pueden inferir de las tasas de fotoblanqueo del donante en presencia y ausencia de un aceptor. ^[18] Este método se puede realizar en la mayoría de los microscopios de fluorescencia; uno simplemente hace brillar la luz de excitación (de una frecuencia que excitará significativamente al donante pero no al aceptor) sobre muestras con y sin el fluoróforo aceptor y monitorea la fluorescencia del donante (generalmente separada de la fluorescencia del aceptor usando un filtro de paso de banda ) a lo largo del tiempo. La escala de tiempo es la del fotoblanqueo, que va de segundos a minutos, y la fluorescencia en cada curva viene dada por

${\displaystyle {\text{background}}+{\text{constant}}\cdot e^{-{\text{time}}/\tau _{\text{pb}}},}$

donde el tiempo de desintegración del fotoblanqueo es constante y depende de si el aceptor está presente o no. Dado que el fotoblanqueo consiste en la inactivación permanente de fluoróforos excitados, la transferencia de energía de resonancia de un fluoróforo donante excitado a un fluoróforo aceptor evita el fotoblanqueo de ese fluoróforo donante y, por lo tanto, una alta eficiencia de FRET conduce a una constante de tiempo de desintegración del fotoblanqueo más larga: ${\displaystyle \tau _{\text{pb}}}$

${\displaystyle E=1-\tau _{\text{pb}}/\tau _{\text{pb}}',}$

donde y son las constantes de tiempo de desintegración del fotoblanqueo del donante en presencia y en ausencia del aceptor, respectivamente. (Observe que la fracción es el recíproco de la utilizada para las mediciones de vida útil). ${\displaystyle \tau _{\text{pb}}'}$ ${\displaystyle \tau _{\text{pb}}}$

Esta técnica fue introducida por Jovin en 1989. ^[31] Su uso de una curva completa de puntos para extraer las constantes de tiempo puede brindarle ventajas de precisión sobre los otros métodos. Además, el hecho de que las mediciones de tiempo sean de segundos en lugar de nanosegundos hace que sea más fácil que las mediciones de vida útil de la fluorescencia, y debido a que las tasas de desintegración del fotoblanqueo generalmente no dependen de la concentración del donante (a menos que la saturación del aceptor sea un problema), el control cuidadoso de las concentraciones necesarias para la intensidad No se necesitan medidas. Sin embargo, es importante mantener la misma iluminación para las mediciones con y sin aceptor, ya que el fotoblanqueo aumenta notablemente con la luz incidente más intensa.

Medidas de vida

La eficiencia de FRET también se puede determinar a partir del cambio en la vida de fluorescencia del donante. ^[18] La vida del donante disminuirá en presencia del aceptor. Las mediciones de la vida útil del donante FRET se utilizan en microscopía de imágenes de fluorescencia de por vida (FLIM).

FRET de una sola molécula (smFRET)

smFRET es un grupo de métodos que utilizan diversas técnicas microscópicas para medir un par de fluoróforos donantes y aceptores que se excitan y detectan a nivel de molécula única. A diferencia del "conjunto FRET" o "bulk FRET", que proporciona la señal FRET de un gran número de moléculas, la FRET de una sola molécula es capaz de resolver la señal FRET de cada molécula individual. La variación de la señal smFRET es útil para revelar información cinética que una medición en conjunto no puede proporcionar, especialmente cuando el sistema está en equilibrio. También se puede observar heterogeneidad entre diferentes moléculas. Este método se ha aplicado en muchas mediciones de dinámica biomolecular como ADN/ARN/plegamiento/desplegamiento de proteínas y otros cambios conformacionales, y dinámica intermolecular como reacción, unión, adsorción y desorción que son particularmente útiles en detección química, bioensayos y biosensores.

Fluoróforos utilizados para FRET

Si el conector está intacto, la excitación en la longitud de onda de absorbancia de CFP (414 nm) provoca la emisión de YFP (525 nm) debido a FRET. Si el conector es escindido por una proteasa, se elimina FRET y la emisión se realiza en la longitud de onda CFP (475 nm).

Pares CFP-YFP

Un par de fluoróforos comunes para uso biológico es un par de proteína fluorescente cian (CFP) y proteína fluorescente amarilla (YFP). ^[32] Ambas son variantes de color de la proteína verde fluorescente (GFP). El etiquetado con tintes fluorescentes orgánicos requiere purificación, modificación química e inyección intracelular de una proteína huésped. Las variantes de GFP se pueden unir a una proteína huésped mediante ingeniería genética , lo que puede resultar más conveniente. Además, se puede utilizar como ensayo de escisión una fusión de CFP e YFP ("dímero en tándem") unidas mediante una secuencia de escisión de proteasa . ^[33]

BRET

Una limitación de FRET realizada con donantes de fluoróforo es el requisito de iluminación externa para iniciar la transferencia de fluorescencia, lo que puede provocar ruido de fondo en los resultados de la excitación directa del aceptor o del fotoblanqueo . Para evitar este inconveniente, se ha desarrollado la transferencia de energía por resonancia de bioluminiscencia (o BRET ). ^{[34] [35] Esta técnica utiliza una} luciferasa bioluminiscente (típicamente la luciferasa de Renilla reniformis ) en lugar de CFP para producir una emisión de fotones inicial compatible con YFP.

BRET también se ha implementado utilizando una enzima luciferasa diferente, diseñada a partir del camarón de aguas profundas Oplophorus gracilirostris . Esta luciferasa es más pequeña (19 kD) y más brillante que la luciferasa más comúnmente utilizada de Renilla reniformis , ^{[36] [37] [38] [39]} y ha sido denominada NanoLuc ^[40] o NanoKAZ. ^[41] Promega ha desarrollado un sustrato patentado para NanoLuc llamado furimazina, ^{[42] [40]} aunque también se han publicado otros valiosos sustratos de coelenterazina para NanoLuc. ^{[41] [43]} Una versión de proteína dividida de NanoLuc desarrollada por Promega ^[44] también se ha utilizado como donante de BRET en experimentos que miden las interacciones proteína-proteína. ^[45]

Homo-FRET

En general, "FRET" se refiere a situaciones en las que las proteínas donadoras y aceptoras (o "fluoróforos") son de dos tipos diferentes. Sin embargo, en muchas situaciones biológicas, los investigadores podrían necesitar examinar las interacciones entre dos o más proteínas del mismo tipo, o incluso la misma proteína consigo misma, por ejemplo si la proteína se pliega o forma parte de una cadena polimérica de proteínas ^{. 46]} o para otras cuestiones de cuantificación en células biológicas ^[47] o experimentos in vitro . ^[48]

Obviamente, las diferencias espectrales no serán la herramienta utilizada para detectar y medir FRET, ya que tanto la proteína aceptora como la donante emiten luz con las mismas longitudes de onda. Sin embargo, los investigadores pueden detectar diferencias en la polarización entre la luz que excita los fluoróforos y la luz que se emite, en una técnica llamada imágenes de anisotropía FRET; el nivel de anisotropía cuantificado (diferencia de polarización entre los haces de excitación y emisión) se convierte en una guía indicativa de cuántos eventos FRET han ocurrido. ^[49]

En el campo de la nanofotónica, FRET puede ser perjudicial si canaliza energía excitónica a sitios defectuosos, pero también es esencial para la recolección de carga en células solares orgánicas y sensibilizadas por puntos cuánticos, y se han propuesto varias estrategias habilitadas para FRET para diferentes dispositivos optoelectrónicos. Por tanto, es esencial comprender cómo se comportan los nanoemisores aislados cuando se apilan en una capa densa. Las nanoplaquetas son candidatos especialmente prometedores para una fuerte difusión de excitones homo-FRET debido a su fuerte acoplamiento dipolar en el plano y su bajo desplazamiento de Stokes. ^[50] El estudio de microscopía de fluorescencia de dichas cadenas simples demostró que la transferencia de energía mediante FRET entre plaquetas vecinas hace que la energía se difunda a lo largo de una longitud típica de 500 nm (aproximadamente 80 nanoemisores), y el tiempo de transferencia entre plaquetas es del orden de 1 ps. . ^[51]

Otros

Varios compuestos además de proteínas fluorescentes. ^[52]

Aplicaciones

Las aplicaciones de la transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET) se han expandido enormemente en los últimos 25 años y la técnica se ha convertido en un elemento básico en muchos campos biológicos y biofísicos . FRET se puede utilizar como regla espectroscópica para medir distancias y detectar interacciones moleculares en varios sistemas y tiene aplicaciones en biología y bioquímica. ^{[28] [53]}

Proteínas

FRET se utiliza a menudo para detectar y rastrear interacciones entre proteínas. ^{[54] [55] [56] [57]} Además, FRET se puede utilizar para medir distancias entre dominios en una sola proteína etiquetando diferentes regiones de la proteína con fluoróforos y midiendo la emisión para determinar la distancia. Esto proporciona información sobre la conformación de las proteínas , incluidas las estructuras secundarias y el plegamiento de las proteínas . ^{[58] [59]} Esto se extiende al seguimiento de cambios funcionales en la estructura de las proteínas, como los cambios conformacionales asociados con la actividad de la miosina . ^[60] Aplicado in vivo, FRET se ha utilizado para detectar la ubicación y las interacciones de estructuras celulares, incluidas integrinas y proteínas de membrana . ^[61]

Membranas

FRET se puede utilizar para observar la fluidez de la membrana , el movimiento y la dispersión de las proteínas de la membrana, las interacciones entre lípidos y proteínas de la membrana y entre proteínas y proteínas, y la mezcla exitosa de diferentes membranas. ^[62] FRET también se utiliza para estudiar la formación y las propiedades de los dominios de membrana y las balsas lipídicas en las membranas celulares ^[63] y para determinar la densidad superficial en las membranas. ^[64]

quimiosensor

Sonda basada en FRET que se activa al interactuar con Cd2+

Las sondas basadas en FRET pueden detectar la presencia de varias moléculas: la estructura de la sonda se ve afectada por la unión o actividad de moléculas pequeñas, que pueden activar o desactivar el sistema FRET. Esto se utiliza a menudo para detectar aniones, cationes, moléculas pequeñas sin carga y también algunas biomacromoléculas más grandes. De manera similar, los sistemas FRET han sido diseñados para detectar cambios en el entorno celular debido a factores como el pH , la hipoxia o el potencial de membrana mitocondrial . ^{[sesenta y cinco]}

Vías de señalización

Otro uso de FRET es en el estudio de vías metabólicas o de señalización . ^[66] Por ejemplo, FRET y BRET se han utilizado en varios experimentos para caracterizar la activación del receptor acoplado a proteína G y los consiguientes mecanismos de señalización. ^[67] Otros ejemplos incluyen el uso de FRET para analizar procesos tan diversos como la quimiotaxis bacteriana ^[68] y la actividad de caspasa en la apoptosis . ^[69]

Cinética de plegamiento de proteínas y nucleótidos.

Se han medido proteínas, ADN, ARN y otras dinámicas de plegamiento de polímeros utilizando FRET. Por lo general, estos sistemas se encuentran en equilibrio cuya cinética está oculta. Sin embargo, se pueden medir midiendo FRET de una sola molécula con la colocación adecuada de los colorantes aceptores y donantes en las moléculas. Consulte FRET de molécula única para obtener una descripción más detallada.

Otras aplicaciones

Además de los usos comunes mencionados anteriormente, FRET y BRET también son eficaces en el estudio de la cinética de reacciones bioquímicas. ^[70] FRET se utiliza cada vez más para controlar el montaje y desmontaje dependiente del pH y es valioso en el análisis de la encapsulación de ácidos nucleicos . ^{[71] [72] [73] [74]} Esta técnica se puede utilizar para determinar los factores que afectan varios tipos de formación de nanopartículas ^{[75] [76]} , así como los mecanismos y efectos de las nanomedicinas . ^[77]

Otros metodos

Un mecanismo diferente, pero relacionado, es la transferencia de electrones de Dexter .

Un método alternativo para detectar la proximidad proteína-proteína es la complementación de fluorescencia bimolecular (BiFC), donde dos partes de una proteína fluorescente se fusionan con otras proteínas. Cuando estas dos partes se encuentran, forman un fluoróforo en una escala de tiempo de minutos u horas. ^[78]

Ver también

• Transferencia de electrones de Dexter
• Acoplamiento Forster
• Transferencia de energía superficial
• Transferencia de energía de fluorescencia resuelta en el tiempo.

Referencias

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enlaces externos

• Efecto FRET en una película delgada en YouTube
• FRET Imaging (Tutorial de Becker & Hickl, sitio web)