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ensayo túnel

Hígado de ratón que muestra una célula apoptótica teñida con TUNEL

El marcaje de extremos de muesca dUTP con desoxinucleotidil transferasa terminal ( TUNEL ) es un método para detectar la fragmentación del ADN marcando los extremos 3′-hidroxilo en las roturas de ADN de doble hebra generadas durante la apoptosis . [1] [2]

Método

TUNEL es un método para detectar la fragmentación del ADN apoptótico , ampliamente utilizado para identificar y cuantificar células apoptóticas o para detectar una rotura excesiva del ADN en células individuales. [3] El ensayo se basa en el uso de la desoxinucleotidil transferasa terminal (TdT), una enzima que cataliza la unión de desoxinucleótidos, marcados con un fluorocromo u otro marcador , a los extremos 3'-hidroxilo de las roturas de la doble cadena del ADN. También puede marcar células que tienen daño en el ADN por otros medios además del curso de la apoptosis.

Historia

El ensayo TUNEL basado en fluorocromo aplicable para citometría de flujo , que combina la detección de roturas de cadenas de ADN con respecto a la posición de la fase del ciclo celular , fue desarrollado originalmente por Gorczyca et al. [4] Al mismo tiempo, Gavrieli et al. describieron el ensayo de etiquetado de avidina-peroxidasa aplicable al microscopio de absorción de luz . [5] Desde 1992 el TUNEL se ha convertido en uno de los principales métodos para detectar la muerte celular programada por apoptosis. [6] Sin embargo, durante años ha habido un debate sobre su precisión, debido a problemas en el ensayo original que causaron que las células necróticas fueran etiquetadas inapropiadamente como apoptóticas. [7] Posteriormente, el método se mejoró drásticamente y, si se realiza correctamente, solo debería identificar células en la última fase de la apoptosis . [8] [9] Los nuevos métodos incorporan los dUTP modificados por fluoróforos o haptenos, incluidos la biotina o el bromo , que pueden detectarse directamente en el caso de un nucleótido modificado con fluorescencia (es decir, fluoresceína-dUTP), o indirectamente con estreptavidina o anticuerpos. , si se utiliza biotina-dUTP o BrdUTP, respectivamente. El más sensible de ellos es el método que utiliza la incorporación de BrdUTP mediante TdT seguida de la detección inmunocitoquímica de BrdU . [10]

Referencias

  1. ^ Gorczyca W, Traganos F, Jesionowska H, ​​Darzynkiewicz Z (1993). "Presencia de roturas de cadenas de ADN y aumento de la sensibilidad del ADN in situ a la desnaturalización en espermatozoides humanos anormales. Analogía con la apoptosis de células somáticas". Resolución de celda exp . 207 (1): 202-205. doi :10.1006/excr.1993.1182. PMID  8391465.
  2. ^ Lozano GM, Bejarano I, Espino J, González D, Ortiz A, García JF, Rodríguez AB, Pariente JA (2009). "La capacitación en gradiente de densidad es el método más adecuado para mejorar la fertilización y reducir la fragmentación del ADN de los espermatozoides positivos de hombres infértiles". Revista de Anatolia de Obstetricia y Ginecología . 3 (1): 1–7.
  3. ^ Lozano GM, Bejarano I, Espino J, González D, Ortiz A, García JF, Rodríguez AB, Pariente JA (2009). "Relación entre la actividad de caspasa y los marcadores apoptóticos en el esperma humano en respuesta al peróxido de hidrógeno y la progesterona". Revista de Reproducción y Desarrollo . 55 (6): 615–621. doi : 10.1262/jrd.20250 . PMID  19734695.
  4. ^ Gorczyca W, Bruno S, Darzynkiewicz RJ, Gong J, Darzynkiewicz Z (1992). "Roturas de la cadena de ADN que ocurren durante la apoptosis: su detección temprana in situ mediante la desoxinucleotidil transferasa terminal y ensayos de traducción de mella y prevención mediante inhibidores de la serina proteasa". Revista Internacional de Oncología . 1 (6): 639–648. doi :10.3892/ijo.1.6.639. PMID  21584593.
  5. ^ Gavrieli Y, Sherman Y, Ben-Sasson SA (1992). "Identificación de muerte celular programada in situ mediante etiquetado específico de fragmentación del ADN nuclear". J. Biol celular . 119 (3): 493–501. doi :10.1083/jcb.119.3.493. PMC 2289665 . PMID  1400587. {{cite journal}}: CS1 maint: multiple names: authors list (link)
  6. ^ Darzynkiewicz Z, Galkowski D, Zhao H (2008). "Análisis de apoptosis por citometría mediante ensayo TUNEL". Métodos . 44 (3): 250–254. doi :10.1016/j.ymeth.2007.11.008. PMC 2295206 . PMID  18314056. 
  7. ^ Grasl-Kraupp B, Ruttkay-Nedecky B, Koudelka H, ​​Bukowska K, Bursch W, Schulte-Hermann R (1995). "La detección in situ de ADN fragmentado (ensayo TUNEL) no logra discriminar entre apoptosis, necrosis y muerte celular autolítica: una nota de advertencia". Hepatología . 21 (5): 1465–8. doi : 10.1002/hep.1840210534 . PMID  7737654. S2CID  28119339.
  8. ^ Negoescu A, Lorimier P, Labat-Moleur F, Drouet C, Robert C, Guillermet C, Brambilla C, Brambilla E (1996). "Marcado de células apoptóticas in situ por el método TUNEL: mejora y evaluación de preparaciones celulares". J Histochem Cytochem . 44 (9): 959–68. doi : 10.1177/44.9.8773561 . PMID  8773561.
  9. ^ Negoescu A, Guillermet C, Lorimier P, Brambilla E, Labat-Moleur F (1998). "Importancia de la fragmentación del ADN en la apoptosis con respecto a la especificidad de TUNEL". Farmacéutico Biomédico . 52 (6): 252–8. doi :10.1016/S0753-3322(98)80010-3. PMID  9755824.
  10. ^ Li X, Darzynkiewicz Z (1995). "Etiquetado de roturas de hebras de ADN con BrdUTP. Detección de apoptosis y proliferación celular". Proliferación celular . 28 (11): 571–579. doi :10.1111/j.1365-2184.1995.tb00045.x. PMID  8555370. S2CID  28993497.

enlaces externos