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Ensayo de exclusión cinética

Figura 1. Una fracción del receptor no unido al ligando en solución es capturada por la fase sólida recubierta de ligando y posteriormente marcada con un anticuerpo secundario fluorescente.

Un ensayo de exclusión cinética ( KinExA ) es un tipo de bioensayo en el que una solución que contiene receptor , ligando y complejo receptor-ligando se expone brevemente a ligando adicional inmovilizado en una fase sólida. [1] [2]

Descripción

Durante el ensayo, una fracción del receptor libre es capturada por el ligando de fase sólida y posteriormente marcada con una molécula secundaria fluorescente (Figura 1). [1] [2] El corto tiempo de contacto con la fase sólida no permite una disociación significativa de los complejos preformados en la solución. [3] Por lo tanto, la disociación de la solución queda “cinéticamente excluida” de contribuir al receptor capturado y la señal resultante proporciona una medida del receptor libre en la solución.

La medición del receptor libre en función del ligando total en una serie de soluciones equilibradas permite calcular la constante de disociación de equilibrio (K d ). [1] [2] [3] [4] [5] [6] [7] [8] La medición del receptor libre con varios puntos antes del equilibrio permite medir la constante de tasa de asociación (k on ). La tasa de disociación (k off ) también se puede medir directamente, sin embargo, generalmente se calcula a partir de la K d medida y la k on medida , (k off = K d * k on ).

Se han utilizado ensayos de exclusión cinética para medir K d en el rango nanomolar a femtomolar . [4] [5] [6] [7] [9] [10]

Aplicaciones

Figura 2. Ejemplo de generación de señal. 1) Carga de microesferas. 2) La solución equilibrada pasa sobre la columna. 3) Introducción de una etiqueta secundaria. 4) Emisión fluorescente del receptor libre capturado.

Debido a que la molécula secundaria fluorescente se aplica después de la captura del receptor libre de la solución (Figura 2), las constantes de unión medidas utilizando un ensayo de exclusión cinética son para moléculas no modificadas en solución y, por lo tanto, reflejan con mayor precisión las interacciones de unión endógenas que los métodos que requieren modificación (normalmente etiquetado o inmovilización) antes de la medición. [1] [2] Se han realizado ensayos de exclusión cinética utilizando moléculas no purificadas, [4] [5] en suero, [7] y han medido la unión a las proteínas de la membrana celular en células completas intactas [8] [11], lo que acerca las interacciones de unión medidas a su estado endógeno.

Las moléculas adecuadas para la medición mediante KinExA son anticuerpos , [4] [7] [12] [13] [14] proteínas recombinantes , [15] [16] [17] moléculas pequeñas, [6] [18] [19] [20] aptámeros , [21] [22] lípidos, [23] [24] nanocuerpos , [25] y toxinas. [12] [26] [27]

El ensayo de exclusión cinética también se ha aplicado para el inmunoensayo de concentración , donde ha demostrado ser capaz de proporcionar la máxima sensibilidad teórica, limitada por K d . [28] [29] Un ejemplo de esta técnica se ha empleado para la detección sensible de contaminantes ambientales casi en tiempo real. [30]

Análisis de afinidad de equilibrio estándar

Se prepara una serie de muestras con la misma concentración de receptor (R) pero en las que se titula la concentración de ligando (L) . Una vez alcanzado el equilibrio, se mide cada muestra haciéndola fluir a través de la columna (Figura 2).

Para la unión reversible 1:1, el Kd de equilibrio se define como

(1) K d ≡k apagado /k encendido =R*L/RL

La unión es reversible, por lo que la conservación de la masa se puede escribir como

(2) RT = R+RL

(3) LT = L + RL

Dónde:

K d = constante de disociación de equilibrio

k on = constante de velocidad de avance

k off = constante de velocidad inversa

R = concentración del sitio receptor libre en equilibrio

L = concentración del sitio de ligando libre en el equilibrio

RL = concentración del complejo en equilibrio

R T = concentración total de receptores

L T = concentración total de ligando

Luego se ajusta una ecuación simple [1] [2] que relaciona la fracción libre de R (=R/R T ) con K d y L T a los datos medidos para encontrar el K d de la interacción.

Análisis de constante de velocidad

Para medir las constantes de velocidad , se mezclan en solución concentraciones conocidas de receptor y ligando y se mide repetidamente la cantidad de receptor libre a lo largo del tiempo a medida que se produce la reacción en fase de solución. El curso temporal de la disminución del receptor libre se ajusta luego a una ecuación de velocidad bimolecular estándar .

(4) d LR /d t = k en ∙R∙L - K d ∙k en ∙RL

donde K d * k on ha sido sustituido por k off .

Referencias

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