El microADN es el subtipo más abundante de ADN circular extracromosómico (eccADN) en humanos, típicamente con una longitud de 200 a 400 pares de bases y enriquecido en secuencias genómicas no repetitivas con una alta densidad de exones. [2] [3] [4] Además, se ha descubierto que el microADN proviene de regiones con islas CpG que se encuentran comúnmente dentro de los UTR 5' y 3'. [3] [4] [5] Al producirse a partir de regiones de transcripción activa, se plantea la hipótesis de que el microADN puede formarse como un subproducto de la reparación del daño del ADN transcripcional. [5] También se cree que el microADN surge de otras vías de reparación del ADN, principalmente debido a que las secuencias parentales del microADN tienen repeticiones directas de 2 a 15 pb en los extremos, lo que resulta en la reparación del deslizamiento de la replicación. [3] Si bien se descubrió recientemente, el papel que desempeña el microADN dentro y fuera de la célula aún no se comprende por completo. [5] Sin embargo, actualmente se cree que el microADN afecta la homeostasis celular a través de la unión de factores de transcripción y se ha utilizado como un biomarcador del cáncer. [5] [6] [7]
El microADN se descubrió a través de protocolos similares a los de la extracción de eccADN. [5] Específicamente, los clones de eccADN se generaron a través de amplificación por desplazamiento múltiple y se secuenciaron con secuenciación de Sanger , lo que condujo al descubrimiento del microADN. [5] Ahora que la secuenciación de alto rendimiento es una práctica más común, la secuencia genómica completa del eccADN de mamíferos se ha obtenido a través de la secuenciación de los productos de amplificación rodantes del eccADN. [5] Luego se utilizaron métodos computacionales para identificar secuencias de unión en el ADN. [4] Los picos encontrados en longitudes de 180 y 380 pb se descubrieron como microADN y se caracterizaron por sus islas CpG y repeticiones directas flanqueantes de 2 a 15 pb. [4]
Desde su descubrimiento, el microADN se ha identificado en todos los tipos de tejidos y en varias muestras, incluidos los tejidos de ratones y las líneas celulares de cáncer humano. [5] [6] Sin embargo, las diferentes especies tienen sitios genómicos únicos que producen específicamente microADN. [5] Debido a que existen puntos genómicos comunes que producen microADN en múltiples tipos de células y tejidos dentro de una especie determinada, existe evidencia de que es posible que no se produzcan únicamente como un subproducto de la síntesis de ADN. [5] Sin embargo, los estudios han revelado agrupaciones separadas de microADN extraído de líneas celulares de diferentes tejidos, lo que sugiere que la formación puede estar vinculada al linaje celular y a los entornos transcripcionales únicos que se encuentran en diferentes tipos de células. [4] [5]
Si bien la formación de microADN aún es incierta, se ha vinculado con la actividad transcripcional y múltiples vías de reparación del ADN. [3] [5] Como el microADN se produce a partir de áreas de alta actividad de transcripción/densidad de exones, podría formarse a partir de la reparación del ADN durante la transcripción. [5] Curiosamente, los híbridos de ADN:ARN de triple cadena formados durante la transcripción, denominados bucles R , tienden a formarse en islas CpG dentro de los UTR 5' y 3', de forma similar al microADN. [3] [5] Los bucles R se correlacionan con el daño del ADN y la inestabilidad genética, lo que sugiere que el microADN puede formarse a partir del bucle de ADN monocatenario (ssADN) durante la respuesta al daño del ADN para los bucles R. [3] [5] [6]
En la replicación de ADN de repeticiones directas cortas (como las que se encuentran en las regiones flanqueantes de las fuentes de genes de microADN), es posible que se formen bucles de ADN, en la cadena parental o producto, a través del deslizamiento de la replicación. [3] [5] Para reparar esto, la vía de reparación de desajustes (MMR) puede eliminar el bucle y, tras la ligadura de los extremos repetidos, se puede producir microADN de cadena sencilla. [3] El microADN ss se convierte entonces en ADN de doble cadena; este proceso aún se desconoce. [5] Es importante señalar que si el bucle se forma en la cadena recién replicada, no hay una eliminación consecuente en el genoma, mientras que las microdeleciones pueden formarse a partir de escisiones en la cadena molde. [3] [5] Para comprender el papel que puede tener MMR en la biogénesis del microADN, se realizó un análisis de la abundancia de microADN en células DT40 tras la eliminación de MSH3 , una proteína esencial en MMR. [3] [5] El microADN resultante de la línea celular DT40 MSH3-/- tuvo un mayor enriquecimiento de islas CpG en comparación con el tipo salvaje, así como una reducción de más del 80% del microADN de doble cadena. [3] [5] Por lo tanto, se plantea la hipótesis de que la vía MMR es esencial para la producción de microADN a partir de islas no CpG en el genoma, mientras que el microADN enriquecido con CpG se forma mediante una vía de reparación diferente. [3]
Nuevamente, debido a la microhomología en el genoma plantilla, si hay una ruptura del ADN o una pausa en la replicación (bloqueo de la horquilla de replicación), el ADN recién sintetizado puede circularizarse en microADN ss. [3] [5] Esto significa que cuando el ADN plantilla se repara después de la creación del microADN, no hay eliminación. [3]
El microADN creado a través de la vía MMR y el bloqueo de la horquilla de replicación es el resultado de errores en la replicación del ADN, sin embargo, hay evidencia de que el microADN también está presente en células que no se dividen. [5] Esto significa que algo de microADN se produce a través de vías de reparación que también ocurren en células quiescentes, como a partir de los extremos 5' de los elementos LINE1 que se sabe que se transponen. [3] [5] Para moverse por el genoma, los transposones de ADN requieren una transposasa para eliminar el transposón de su sitio original y catalizar su inserción en otra parte del genoma. [3] Por lo tanto, el transposón se crea por dos roturas de ADN de doble cadena, creando también una microdeleción en el ADN. [3] Este fragmento de dsADN se puede circularizar a través de la circularización mediada por microhomología, creando un microADN ds. [3]
Al tener una longitud de 200 a 400 pb, el microADN es demasiado pequeño para codificar proteínas; sin embargo, puede ser importante para la esponjación molecular. [4] [5] Los factores de transcripción a menudo se unen a secuencias promotoras o reguladoras en el extremo 5' del ADN para iniciar la transcripción. [5] Estos factores de transcripción también pueden unirse a sus respectivos sitios de reconocimiento en el microADN porque el microADN a menudo se origina a partir de los UTR 5' de su gen parental, por lo tanto, actúa como una esponja para los factores de transcripción. [4] [5] Esto significa que el microADN puede controlar indirectamente la expresión génica y la homeostasis de la transcripción. [4] [5]
En general, las moléculas de ácido nucleico que se encuentran en el torrente sanguíneo, denominadas circulantes o libres de células, son un biomarcador de enfermedad relativamente nuevo que se está investigando, incluso para el diagnóstico y la progresión del cáncer. [7] Estas moléculas, como el ADN libre de células (cfDNA), se liberan en la sangre tras la muerte celular y, en casos de cáncer, se pueden identificar en función de las mutaciones conocidas en los oncogenes. [7]
Estudios recientes han extendido el uso de ácidos nucleicos libres de células como biomarcadores de cáncer al microADN. [7] El cfmicroADN se obtuvo del suero humano y de ratón y debido a sus similitudes con el microADN derivado de células, como se describió anteriormente, se concluyó que el cfmicroADN se produce en la célula. [7] De manera similar, al comparar el tejido pulmonar antes y después de la extirpación del tumor, no se encontraron diferencias en las características clave del microADN circulante, aparte de una tendencia inesperada de secuencias de microADN circulantes más largas en pacientes con cáncer antes de la extirpación del tumor. [7] Se encontró que la longitud del cfmicroADN era más corta después de la cirugía. [7]
El ADN libre de células se elimina rápidamente de la sangre, lo que lo convierte en un biomarcador de cáncer difícil. [7] Sin embargo, debido a que el ADN circular no es susceptible a la rotura del ADN por la ARNasa y la exonucleasa , es más estable que el ADN lineal. [5] [7] En combinación con el alargamiento observado del cfmicroDNA en el suero de pacientes con cáncer, esto hace que el microDNA circulante sea un buen biomarcador de cáncer tanto para el diagnóstico como para la progresión después del tratamiento. [7]