Diagrama de niveles de energía que muestra la relación entre Rayleigh, Raman y la dispersión y fluorescencia de Raman por resonancia.
La espectroscopia de resonancia Raman ( espectroscopia RR o RRS ) es una variante de la espectroscopia Raman en la que la energía del fotón incidente tiene una energía cercana a la de una transición electrónica de un compuesto o material bajo examen. [1] Esta similitud en la energía ( resonancia ) conduce a una intensidad mucho mayor de la dispersión Raman de ciertos modos vibratorios, en comparación con la espectroscopia Raman ordinaria.
La espectroscopia Raman de resonancia tiene una sensibilidad mucho mayor que la espectroscopia Raman sin resonancia, lo que permite el análisis de compuestos con intensidades de dispersión Raman inherentemente débiles o en concentraciones muy bajas. [2] [3] También mejora selectivamente sólo ciertas vibraciones moleculares (las del grupo químico que sufre la transición electrónica), lo que simplifica los espectros. [3] Para moléculas grandes como las proteínas , esta selectividad ayuda a identificar modos de vibración de partes específicas de la molécula o proteína , como la unidad hemo dentro de la mioglobina . [4] La espectroscopia de resonancia Raman se ha utilizado en la caracterización de compuestos y complejos inorgánicos, [5] proteínas, [6] [7] ácidos nucleicos, [8] pigmentos, [8] y en arqueología e historia del arte. [8]
Teoría
En la dispersión Raman, los fotones chocan con una muestra y se dispersan con una diferencia de energía: los fotones dispersados pueden tener mayor o menor energía (tener una longitud de onda más corta o más larga ) que los fotones incidentes. Esta diferencia de energía es causada por la excitación de la muestra a un nivel de energía vibratoria mayor o menor: si la muestra estaba inicialmente en un estado vibratorio excitado, el fotón dispersado puede tener mayor energía que el fotón incidente ( dispersión Raman anti-Stokes ). . De lo contrario, el fotón dispersado tiene un módulo de energía más bajo que el fotón entrante ( dispersión Stokes Raman ). Entre los dos fenómenos, el cambio de Stokes y el cambio anti-Stokes, el primero es el que tiene más probabilidades de ocurrir. Como consecuencia, la intensidad relativa de los espectros Raman adquiridos en el modo Stokes es más intensa que la otra. Para la mayoría de los materiales, la dispersión Raman es extremadamente débil en comparación con la dispersión Rayleigh , en la que la luz se dispersa sin pérdida de energía. [9] Por lo tanto, la luz dispersada por Raman, que contiene información sobre las transiciones vibratorias , es difícil de observar en muchas sustancias.
La espectroscopia de resonancia Raman aprovecha un aumento en la intensidad de la dispersión Raman cuando los fotones incidentes coinciden con la energía de una transición electrónica . Si la energía del fotón que golpea la muestra es igual o cercana a la de una transición electrónica en la muestra, ciertos modos vibratorios activos Raman (aquellos que producen un desplazamiento nuclear en la misma dirección que la transición electrónica [10]) exhibirán una energía mucho mayor. dispersión, hasta 10 6 veces en comparación con Raman sin resonancia. [3] Para modos totalmente simétricos , este aumento de la intensidad de dispersión resulta del llamado término A o dispersión de Franck-Condon , debido a las superposiciones de Franck-Condon distintas de cero entre los estados fundamental y excitado. Los modos no totalmente simétricos también pueden mejorarse mediante dispersión de término B o de Herzberg-Teller, si la simetría del modo está contenida en el producto directo de las dos simetrías de estados electrónicos. [11] La mejora de la resonancia es más evidente en el caso de transiciones π-π* y menor para las transiciones centradas en metales (d–d) . [5] Al igual que la espectroscopia Raman ordinaria, RRS observa transiciones vibratorias que producen un cambio distinto de cero en la polarizabilidad de la molécula o material que se está estudiando.
La dispersión Raman por resonancia se diferencia de la fluorescencia en que se produce sin relajación vibratoria durante la vida del estado electrónico excitado. Por tanto, presenta anchos de línea mucho más estrechos que la fluorescencia. [11] Sin embargo, la dispersión de fluorescencia y resonancia Raman coexisten en muchos materiales, y la interferencia de la fluorescencia puede complicar la recopilación de espectros de resonancia Raman. [3]
Variantes
Normalmente, la espectroscopia Raman de resonancia se realiza de la misma manera que la espectroscopia Raman ordinaria, utilizando una única fuente de luz láser para excitar la muestra. La diferencia es la elección de la longitud de onda del láser, que debe seleccionarse para que coincida con la energía de una transición electrónica en la muestra. Por lo tanto, a menudo se utiliza un láser sintonizable para la espectroscopia Raman de resonancia, ya que se puede utilizar un único láser para generar muchas longitudes de onda de excitación posibles para hacer coincidir diferentes muestras. [8] Mediante el uso de múltiples láseres, láseres pulsados y/o ciertas técnicas de preparación de muestras, se puede realizar una variedad de variantes más sofisticadas de RRS, que incluyen:
Espectroscopia Raman de resonancia resuelta en el tiempo : mediante el uso de láseres pulsados con un retraso controlable entre pulsos, la espectroscopia Raman de resonancia se puede utilizar para monitorear los cambios en la muestra a lo largo del tiempo, luego de un cambio fotoquímico inducido por el láser o un aumento de temperatura. [12] Este método se ha utilizado para examinar la dinámica de los estados electrónicos excitados, [13] la unión de oxígeno u otros gases a proteínas que contienen hemo , [14] y la dinámica de las proteínas . [12] [15]
Espectroscopia de resonancia hiper-Raman : la excitación de la muestra se produce mediante la absorción de dos fotones , en lugar de la absorción de un solo fotón. Esta disposición permite la excitación de modos que están prohibidos en la espectroscopia Raman de resonancia ordinaria, con una mejora de la intensidad debido a la resonancia, y también simplifica la recolección de luz dispersa. Es especialmente útil para moléculas que son a la vez polares y polarizables. [dieciséis]
"Espectroscopia Raman de resonancia mejorada en superficie : un híbrido de RRS y dispersión Raman mejorada en superficie ". La muestra se aplica a nanopartículas conductoras y para la excitación se utiliza un láser que coincide con la resonancia del plasmón superficial de las nanopartículas. Si la longitud de onda del plasmón de superficie coincide con la de una transición electrónica en la muestra, la dispersión Raman mejorará enormemente en comparación con la RRS ordinaria. [17]
Microscopía Raman de resonancia : se utiliza un microscopio para enfocar el láser de excitación en un punto particular de la muestra, y se recopilan espectros para muchos de esos puntos. Luego, la intensidad Raman en diferentes puntos se puede ensamblar en una imagen microscópica de la muestra. Mediante la elección adecuada de la longitud de onda de excitación, se puede realizar un mapa microscópico de la distribución únicamente de un componente de interés. [18]
Aplicaciones
Espectros Raman de resonancia (arriba) y no resonancia (abajo) de MoS 2 sobre silicio. Tenga en cuenta que la excitación a 633 nm, cerca de una transición electrónica, provoca la aparición de bandas que son demasiado débiles para ser visibles con la excitación a 532 nm. Figura cortesía de David Tuschel.[1]
Debido a su selectividad y sensibilidad, la espectroscopia Raman de resonancia se utiliza normalmente para estudiar vibraciones moleculares en compuestos que tendrían espectros Raman muy débiles y/o complejos en ausencia de mejora de resonancia. Al igual que la espectroscopia Raman ordinaria, la resonancia Raman es compatible con muestras en agua, que tiene una intensidad de dispersión muy débil y poca contribución a los espectros. Sin embargo, la necesidad de un láser de excitación con una longitud de onda que coincida con la de una transición electrónica en el analito de interés limita en cierta medida la aplicabilidad del método. [8]
pigmentos y colorantes
Los tintes y pigmentos, todos los cuales exhiben transiciones electrónicas en la parte visible del espectro electromagnético, estuvieron entre las primeras sustancias estudiadas mediante espectroscopia de resonancia Raman. En 1970 se informaron espectros de resonancia Raman de betacaroteno y licopeno en muestras de plantas intactas . [8] Desde entonces, el método se ha utilizado para medir de forma no invasiva los niveles de estos nutrientes en la piel humana. [19] Los espectros de resonancia Raman de otros pigmentos poliénicos, como el esferoideno y el retiniano , se han utilizado para identificar diferencias en la conformación de cromóforos en proteínas fotoactivas. [20] [21] La espectroscopia de resonancia Raman se ha utilizado en arqueología para identificar tintes y pigmentos en artefactos culturales, y la capacidad de RRS para distinguir diferentes tintas y tintes modernos ha encontrado aplicación en la ciencia forense . [8]
Proteínas
Las proteínas han sido ampliamente examinadas mediante espectroscopia de resonancia Raman. Los cofactores unidos a proteínas que se absorben en el rango de longitud de onda visible, como el hemo , las flavinas o los complejos de metales de transición , pueden examinarse mediante RRS con una superposición espectral mínima con respecto al resto de la molécula. [7] [22] Este método se ha utilizado para examinar la unión de gases en hemoproteínas [23] y el ciclo catalítico de varias enzimas. [24] Utilizando la excitación con láser ultravioleta , es posible excitar selectivamente las cadenas laterales de aminoácidos aromáticos ( fenilalanina , tirosina y triptófano ) para deducir el entorno local y las interacciones de los enlaces de hidrógeno de estos residuos. [25] Con excitación ultravioleta de longitud de onda más corta ("profunda"), también es posible excitar los enlaces peptídicos de una proteína para examinar la estructura secundaria . El plegamiento y la desnaturalización de proteínas se han examinado mediante espectroscopia Raman de resonancia UV profunda de la columna vertebral del polipéptido, con longitudes de onda de excitación inferiores a 200 nm. [25]
Ácidos nucleicos y virus.
La espectroscopia de resonancia Raman con excitación ultravioleta se puede utilizar para examinar la química, la estructura y las interacciones intermoleculares de los ácidos nucleicos , específicamente las bases. Las interacciones entre los ácidos nucleicos y los compuestos que se unen al ADN, como los fármacos, pueden examinarse excitando selectivamente las nucleobases o el propio fármaco. [8] Los espectros de resonancia Raman del ADN se pueden utilizar para identificar ADN bacteriano en células vivas y para cuantificar el ADN en diferentes condiciones de cultivo, e incluso para distinguir diferentes especies bacterianas. [8] Los virus también se han estudiado utilizando espectroscopia Raman de resonancia UV; el método tiene la capacidad de interrogar por separado la estructura del ácido nucleico o los componentes de la proteína de la cápside del virus, mediante la elección de la longitud de onda de excitación adecuada. [26]
Nanomateriales
La espectroscopia de resonancia Raman también se ha utilizado para caracterizar la estructura y las propiedades fotofísicas de las nanopartículas . Utilizando láseres sintonizados con las transiciones electrónicas visibles e infrarrojas cercanas de los nanotubos de carbono , es posible mejorar las bandas vibratorias de los nanotubos sensibles a la estructura. [8] También se ha demostrado que los nanocables de materiales semiconductores inorgánicos , incluido el fosfuro de galio y el telururo de mercurio encapsulado en carbono , exhiben espectros de resonancia Raman con luz de excitación visible. [27] [28]
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