El flujo detenido es una técnica experimental para estudiar reacciones químicas con un tiempo medio del orden de 1 ms, introducida por Britton Chance [1] [2] y ampliada por Quentin Gibson [3] (existen otras técnicas, como el método del salto de temperatura , [4] para procesos mucho más rápidos).
La espectrometría de flujo detenido permite estudiar la cinética química de reacciones rápidas (con tiempos medios del orden de milisegundos) en solución. Al principio se utilizó principalmente para estudiar reacciones catalizadas por enzimas. Luego, el flujo detenido encontró rápidamente su lugar en casi todos los laboratorios de bioquímica, biofísica y química que necesitaban seguir las reacciones químicas en la escala de tiempo de milisegundos. En su forma más simple, un flujo detenido mezcla dos soluciones. Pequeños volúmenes de soluciones se introducen rápida y continuamente en un mezclador de alta eficiencia. Este proceso de mezcla inicia una reacción extremadamente rápida. La solución recién mezclada viaja a la celda de observación y empuja el contenido de la celda (la solución restante del experimento anterior o de los pasos de lavado necesarios). El tiempo necesario para que esta solución pase del punto de mezcla al punto de observación se conoce como tiempo muerto. El volumen mínimo de inyección dependerá del volumen de la celda de mezcla. Una vez que se ha inyectado suficiente solución para eliminar por completo la solución anterior, el instrumento alcanza un estado estacionario y se puede detener el flujo. Dependiendo de la tecnología de accionamiento de la jeringa, la detención del flujo se logra mediante una válvula de detención llamada "hard-stop" o mediante una jeringa de detención. El flujo detenido también envía una "señal de inicio" al detector llamado disparador para que se pueda observar la reacción. El tiempo del disparador generalmente está controlado por software para que el usuario pueda activarlo al mismo tiempo que se detiene el flujo o unos milisegundos antes de la detención para verificar que se haya alcanzado el estado estacionario.
Dos jeringas están llenas de soluciones que no experimentan ninguna reacción química hasta que se mezclan. Estas tienen pistones que son accionados por un solo pistón de accionamiento o por motores paso a paso independientes, de modo que se acoplan entre sí y su contenido es expulsado simultáneamente hacia un dispositivo mezclador.
Una vez que las dos soluciones salen de las jeringas, ingresan a un sistema de mezcla que tiene deflectores para garantizar una mezcla completa, con flujo turbulento en lugar de flujo laminar. (El flujo laminar permitiría que las dos soluciones fluyeran una al lado de la otra sin una mezcla incompleta).
El tiempo muerto es el tiempo que tardan las soluciones en llegar desde el punto de mezcla hasta el punto de observación; es la parte de la cinética que no se puede observar. Por lo tanto, cuanto menor sea el tiempo muerto, más información puede obtener el usuario. En instrumentos más antiguos, este tiempo muerto podía ser del orden de 1 ms, pero las mejoras actuales permiten alcanzar un tiempo muerto de aproximadamente 0,3 ms. [5]
Los reactivos mezclados pasan por una celda de observación que permite seguir la reacción espectrofotométricamente, típicamente por espectroscopia ultravioleta , espectroscopia de fluorescencia , dicroísmo circular o dispersión de luz , y ahora es común combinar varias de estas. [6] Las cubetas de observación con un camino de luz corto (0,75 a 1,5 mm) suelen preferirse para las mediciones de fluorescencia para reducir los efectos de autoabsorción. Las cubetas de observación con un camino de luz más largo (0,5 cm a 1 cm) se prefieren para las mediciones de absorbancia. El flujo detenido moderno puede acomodar diferentes modelos de celdas y es posible cambiar la cubeta entre dos experimentos. Para las mediciones de rayos X de flujo detenido, se utiliza un capilar de cuarzo con pared delgada para minimizar la absorción de cuarzo. Las mediciones simultáneas de rayos X y absorbancia son posibles en el mismo capilar.
Una vez que pasa por la celda de observación, la mezcla ingresa a una tercera jeringa que contiene un pistón que es impulsado por el flujo para activar un interruptor para detener el flujo y activar la observación.
El método de flujo detenido es un desarrollo del método de flujo continuo utilizado por Hamilton Hartridge y Francis Roughton [7] para estudiar la unión del O 2 a la hemoglobina. En ausencia de cualquier sistema de parada, la mezcla de reacción pasaba a un tubo largo más allá de un sistema de observación (que en 1923 consistía en un colorímetro simple) para su desecho. Al mover el colorímetro a lo largo del tubo y conocer el caudal, Hartridge y Roughton pudieron medir el proceso después de un tiempo conocido.
En su momento, esto supuso un avance revolucionario que demostraba que un problema aparentemente insoluble (estudiar un proceso que tardaba milisegundos con un equipo que requería segundos para cada medición) podía resolverse con un equipo sencillo. Sin embargo, en la práctica estaba limitado a los reactivos disponibles en grandes cantidades: en el caso de las proteínas, esto lo limitaba efectivamente a las reacciones de la hemoglobina. A efectos prácticos, este enfoque está obsoleto.
El método de flujo detenido depende de la existencia de propiedades espectroscópicas que se puedan utilizar para seguir la reacción. Cuando ese no es el caso, el flujo enfriado proporciona una alternativa que utiliza métodos químicos convencionales para el análisis. [8] En lugar de un sistema de parada mecánico, la reacción se detiene por extinción , y los productos se entregan a un recipiente que detiene la reacción inmediatamente, ya sea por congelación instantánea o desnaturalizando la enzima con un desnaturalizante químico o exponiendo la muestra a una fuente de luz desnaturalizante. Al igual que en el método de flujo continuo, el tiempo entre la mezcla y la extinción se puede variar variando la longitud del tubo.
El método de flujo pulsado en reposo introducido por Alan Fersht y Ross Jakes [9] evita la necesidad de un tubo largo. La reacción se inicia exactamente como en un experimento de flujo detenido, pero hay una tercera jeringa que produce el apagado en un tiempo definido y preestablecido después del inicio.
El flujo extinguido tiene ventajas y desventajas con respecto al flujo detenido. Por un lado, el análisis químico deja claro qué proceso se está midiendo, mientras que no siempre es obvio qué proceso representa una señal espectroscópica. Por otro lado, el flujo extinguido es mucho más laborioso, ya que cada punto a lo largo del curso temporal debe determinarse por separado. La imagen de la izquierda para la catálisis por nitrogenasa de Klebsiella pneumoniae [10] ilustra ambos puntos: la concordancia en tiempos medios indica que la absorbancia a 420 nm midió la liberación de P i , pero el experimento de flujo extinguido requirió 11 puntos de datos.