El cultivo por lotes alimentados se define, en el sentido más amplio, como una técnica operativa en procesos biotecnológicos en los que uno o más nutrientes (sustratos) se alimentan (suministran) al biorreactor durante el cultivo y en los que los productos permanecen en el biorreactor hasta el final de la carrera. [1] Una descripción alternativa del método es la de un cultivo en el que "un medio base apoya el cultivo celular inicial y se agrega un medio de alimentación para evitar el agotamiento de nutrientes". [2] También es un tipo de cultivo semi-discontinuo . En algunos casos, todos los nutrientes se introducen en el biorreactor. La ventaja del cultivo discontinuo alimentado es que se puede controlar la concentración de sustrato alimentado en el líquido de cultivo a niveles arbitrariamente deseados (en muchos casos, a niveles bajos).
En términos generales, el cultivo discontinuo alimentado es superior al cultivo discontinuo convencional cuando el control de las concentraciones de un nutriente (o nutrientes) afecta el rendimiento o la productividad del metabolito deseado.
Los tipos de bioprocesos para los cuales el cultivo discontinuo es eficaz se pueden resumir de la siguiente manera:
1. Inhibición del sustrato [1]
Nutrientes como el metanol, el etanol, el ácido acético y los compuestos aromáticos inhiben el crecimiento de microorganismos incluso en concentraciones relativamente bajas. Añadiendo adecuadamente dichos sustratos se puede acortar el tiempo de retardo y reducir notablemente la inhibición del crecimiento celular.
2. Alta densidad celular (alta concentración celular) [1]
En un cultivo discontinuo, para lograr concentraciones celulares muy altas, por ejemplo, 50-100 g de células secas/l, se necesitan altas concentraciones iniciales de nutrientes en el medio. En concentraciones tan altas, los nutrientes se vuelven inhibidores, aunque no tienen tal efecto en las concentraciones normales utilizadas en cultivos discontinuos.
3. Efecto glucosa ( efecto Crabtree ) [1]
En la producción de levadura de panadería a partir de mosto de malta o melaza, desde principios del siglo XX se ha reconocido que se produce etanol incluso en presencia de suficiente oxígeno disuelto (OD) si hay un exceso de azúcar en el líquido de cultivo. El etanol es la causa principal del bajo rendimiento celular. La formación aeróbica de etanol en presencia de una concentración de glucosa se conoce como efecto glucosa o efecto Crabtree. Para reducir este efecto, generalmente se emplea un proceso discontinuo para la producción de levadura de panadería. En cultivos aeróbicos de Escherichia coli y Bacillus subtilis , los ácidos orgánicos como el ácido acético (y en menores cantidades, el ácido láctico y el ácido fórmico) se producen como subproductos cuando la concentración de azúcar es alta, y estos ácidos inhiben el crecimiento celular y muestran efecto de deterioro sobre las actividades metabólicas. La formación de estos ácidos se denomina efecto Crabtree bacteriano.
4. Represión de catabolitos [1]
Cuando a un microorganismo se le proporciona una fuente de energía de carbono rápidamente metabolizable, como la glucosa, el aumento resultante en la concentración intracelular de ATP conduce a la represión de la biosíntesis de enzimas, provocando así una metabolización más lenta de la fuente de energía. Este fenómeno se conoce como represión catabólica. Muchas enzimas, especialmente las implicadas en las vías catabólicas, están sujetas a esta regulación represiva. Un método poderoso para superar la represión de catabolitos en la biosíntesis de enzimas es un cultivo discontinuo en el que la concentración de glucosa en el líquido de cultivo se mantiene baja, donde se restringe el crecimiento y se desreprime la biosíntesis de enzimas. La alimentación lenta de glucosa en la fermentación de penicilina por parte de Penicillium chrysogenum es un ejemplo clásico de esta categoría.
5. Mutantes auxotróficos [1]
En un proceso microbiano que emplea un mutante auxotrófico (mutante que requiere nutrición), el suministro excesivo del nutriente requerido da como resultado un crecimiento celular abundante con poca acumulación del metabolito deseado debido a la inhibición por retroalimentación y/o la represión del producto final. Sin embargo, la falta del nutriente requerido reduce el crecimiento celular, así como la producción general del metabolito deseado, ya que la tasa de producción suele ser proporcional a la concentración celular. En tal bioproceso, la acumulación del metabolito deseado se puede maximizar haciendo crecer el mutante con una cantidad limitada del nutriente requerido. Para cultivar el mutante con una concentración baja del nutriente requerido, se introduce en el cultivo discontinuo a una velocidad controlada. Esta técnica se utiliza a menudo en producciones industriales de aminoácidos con mutantes auxotróficos. Un ejemplo es la producción de lisina en la que falta un mutante de Corynebacterium glutamicum que requiere homoserina o treonina/metionina para el gen de la homoserina deshidrogenasa.
6. Control de expresión de un gen con un promotor reprimible
La transcripción de un gen que tiene un promotor reprimible aguas arriba del marco de lectura abierto se reprime mediante la combinación del llamado holorepresor con la región operadora del ADN. Cuando existe un compuesto químico específico en el líquido de cultivo, el compuesto (o su metabolito) en las células se combina como co-represor con un apo-represor (una especie de factor de transcripción) para formar el holo-represor. Mantener la concentración de este compuesto lo más baja posible (sin dejar de permitir un crecimiento celular suficiente) permite la expresión continua del gen regulado. La cultura por lotes alimentados es una técnica poderosa para hacerlo. Ejemplos de promotor reprimible son el promotor trp y el promotor phoA .
7. Ampliación del tiempo de operación, suplemento de agua perdida por evaporación y disminución de la viscosidad del caldo de cultivo [1]
La estrategia feed-batch se utiliza normalmente en procesos bioindustriales para alcanzar una alta densidad celular en el biorreactor . [3] [4] [5] [6] Principalmente, la solución de alimentación está altamente concentrada para evitar la dilución del biorreactor. Se ha estudiado ampliamente la producción de proteínas heterólogas mediante cultivos discontinuos de microorganismos recombinantes. [7] [8] [9] [10]
La adición controlada del nutriente afecta directamente la tasa de crecimiento del cultivo y ayuda a evitar el metabolismo desbordante (formación de metabolitos secundarios, como el acetato de Escherichia coli , el ácido láctico en cultivos de células de mamíferos, el etanol en Saccharomyces cerevisiae ), la limitación de oxígeno (anaerobiosis). ). [11] [12]
El cultivo discontinuo alimentado más simple es aquel en el que la velocidad de alimentación de un sustrato limitante del crecimiento es constante, es decir, la velocidad de alimentación es invariante durante el cultivo. Este caso se muestra en el gráfico (aquí el volumen de cultivo es variable). Este tipo de cultivo discontinuo se denomina cultivo discontinuo alimentado constantemente (CFBC) y está bien establecido matemáticamente [13] y experimentalmente. [14] En el CFBC se estudiaron tanto casos de CFBC de volumen fijo como de CFBC de volumen variable.
En condiciones ideales, las células crecen exponencialmente. Si la tasa de alimentación del sustrato limitante del crecimiento aumenta en proporción a la tasa de crecimiento exponencial de las células, es posible mantener la tasa de crecimiento específica de las células durante mucho tiempo mientras se mantiene constante la concentración del sustrato en el líquido de cultivo. nivel. La velocidad de alimentación requerida (volumétrica o en masa) debe aumentar exponencialmente con el tiempo, de modo que este modo de cultivo discontinuo alimentado se denomina cultivo discontinuo alimentado exponencialmente (EFBC). [15]
La limitación del sustrato ofrece la posibilidad de controlar las velocidades de reacción para evitar limitaciones tecnológicas relacionadas con el enfriamiento del reactor y la transferencia de oxígeno. La limitación del sustrato también permite el control metabólico, para evitar efectos osmóticos, represión de catabolitos y metabolismo desbordante de productos secundarios. [16] [17] [18]
Se pueden utilizar diferentes estrategias para controlar el crecimiento en un proceso feed-batch: