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Dielectroforesis

Dielectroforesis que ensambla células cancerosas en un modelo microfluídico 3D.

La dielectroforesis ( DEP ) es un fenómeno en el que se ejerce una fuerza sobre una partícula dieléctrica cuando se somete a un campo eléctrico no uniforme . [1] [2] [3] [4] [5] [6] Esta fuerza no requiere que la partícula esté cargada . Todas las partículas exhiben actividad dielectroforética en presencia de campos eléctricos. Sin embargo, la intensidad de la fuerza depende en gran medida del medio y de las propiedades eléctricas de las partículas, de la forma y el tamaño de las partículas, así como de la frecuencia del campo eléctrico. En consecuencia, los campos de una frecuencia particular pueden manipular partículas con gran selectividad. Esto ha permitido, por ejemplo, la separación de células o la orientación y manipulación de nanopartículas [2] [7] y nanocables. [8] Además, un estudio del cambio en la fuerza DEP en función de la frecuencia puede permitir dilucidar las propiedades eléctricas (o electrofisiológicas en el caso de las células) de la partícula.

Antecedentes y propiedades

Aunque el fenómeno que ahora llamamos dielectroforesis fue descrito de pasada ya a principios del siglo XX, solo fue objeto de un estudio serio, nombrado y comprendido por primera vez por Herbert Pohl en la década de 1950. [9] [10] Recientemente, la dielectroforesis ha revivido debido a su potencial en la manipulación de micropartículas , [2] [4] [5] [11] nanopartículas y células .

La dielectroforesis ocurre cuando una partícula polarizable se suspende en un campo eléctrico no uniforme. El campo eléctrico polariza la partícula y los polos experimentan una fuerza a lo largo de las líneas de campo, que puede ser atractiva o repulsiva según la orientación en el dipolo. Dado que el campo no es uniforme, el polo que experimenta el mayor campo eléctrico dominará sobre el otro y la partícula se moverá. La orientación del dipolo depende de la polarizabilidad relativa de la partícula y el medio, de acuerdo con la polarización de Maxwell-Wagner-Sillars . Dado que la dirección de la fuerza depende del gradiente de campo en lugar de la dirección del campo, la DEP se producirá tanto en campos eléctricos de CA como de CC; la polarización (y, por lo tanto, la dirección de la fuerza) dependerá de las polarizabilidades relativas de la partícula y el medio. Si la partícula se mueve en la dirección del aumento del campo eléctrico, el comportamiento se conoce como DEP positiva (a veces pDEP), si actúa para alejar la partícula de las regiones de alto campo, se conoce como DEP negativa (o nDEP). Como las polarizabilidades relativas de la partícula y el medio dependen de la frecuencia, la variación de la señal energizante y la medición de la forma en que cambia la fuerza se pueden utilizar para determinar las propiedades eléctricas de las partículas; esto también permite la eliminación del movimiento electroforético de las partículas debido a la carga inherente de las partículas.

Los fenómenos asociados con la dielectroforesis son la electrorotación y la dielectroforesis de ondas viajeras (TWDEP). Estas requieren un equipo complejo de generación de señales para crear los campos eléctricos rotatorios o viajeros necesarios y, como resultado de esta complejidad, han encontrado menos aceptación entre los investigadores que la dielectroforesis convencional.

Fuerza dielectroforética

El modelo teórico más simple es el de una esfera homogénea rodeada por un medio dieléctrico conductor. [12] Para una esfera homogénea de radio y permitividad compleja en un medio con permitividad compleja la fuerza DEP (promediada en el tiempo) es: [4]

El factor entre llaves se conoce como función compleja de Clausius-Mossotti [2] [4] [5] y contiene toda la dependencia de la frecuencia de la fuerza DEP. Cuando la partícula consiste en esferas anidadas –el ejemplo más común de las cuales es la aproximación de una célula esférica compuesta por una parte interna (el citoplasma) rodeada por una capa externa (la membrana celular)– entonces esto puede representarse mediante expresiones anidadas para las capas y la forma en que interactúan, lo que permite dilucidar las propiedades cuando hay suficientes parámetros relacionados con el número de incógnitas que se buscan. Para un elipsoide alineado al campo más general de radio y longitud con constante dieléctrica compleja en un medio con constante dieléctrica compleja, la fuerza dielectroforética dependiente del tiempo está dada por: [4]

La constante dieléctrica compleja es , donde es la constante dieléctrica , es la conductividad eléctrica , es la frecuencia de campo y es la unidad imaginaria . [2] [4] [5] Esta expresión ha sido útil para aproximar el comportamiento dielectroforético de partículas como glóbulos rojos (como esferoides achatados) o tubos delgados y largos (como elipsoides alargados) permitiendo la aproximación de la respuesta dielectroforética de nanotubos de carbono o virus del mosaico del tabaco en suspensión. Estas ecuaciones son precisas para partículas cuando los gradientes de campo eléctrico no son muy grandes (por ejemplo, cerca de los bordes de los electrodos) o cuando la partícula no se mueve a lo largo de un eje en el que el gradiente de campo es cero (como en el centro de una matriz de electrodos axisimétricos), ya que las ecuaciones solo tienen en cuenta el dipolo formado y no la polarización de orden superior . [4] Cuando los gradientes de campo eléctrico son grandes, o cuando hay un nulo de campo que atraviesa el centro de la partícula, los términos de orden superior se vuelven relevantes, [4] y dan como resultado fuerzas mayores. Para ser precisos, la ecuación dependiente del tiempo sólo se aplica a partículas sin pérdidas, porque la pérdida crea un desfase entre el campo y el dipolo inducido. Cuando se promedia, el efecto se cancela y la ecuación es válida también para partículas con pérdidas. Se puede obtener fácilmente una ecuación promediada en el tiempo equivalente reemplazando E por E rms o, para voltajes sinusoidales, dividiendo el lado derecho por 2. Estos modelos ignoran el hecho de que las células tienen una estructura interna compleja y son heterogéneas. Se puede utilizar un modelo de múltiples capas en un medio de baja conducción para obtener información de la conductividad de la membrana y la permitividad del citoplasma. [13] Para una célula con una capa que rodea un núcleo homogéneo con su medio circundante considerado como una capa, como se ve en la Figura 2, la respuesta dieléctrica general se obtiene a partir de una combinación de las propiedades de la capa y el núcleo. [14]

donde 1 es el núcleo (en términos celulares, el citoplasma), 2 es la envoltura (en una célula, la membrana). r1 es el radio desde el centro de la esfera hasta el interior de la envoltura, y r2 es el radio desde el centro de la esfera hasta el exterior de la envoltura.

Aplicaciones

La dielectroforesis se puede utilizar para manipular, transportar, separar y clasificar distintos tipos de partículas. La DEP se aplica en campos como el diagnóstico médico, el descubrimiento de fármacos, la terapia celular y la filtración de partículas.

La DEP también se ha utilizado en combinación con la tecnología de chips semiconductores para el desarrollo de la tecnología de matriz DEP para la gestión simultánea de miles de células en dispositivos microfluídicos. Los microelectrodos individuales en el suelo de una celda de flujo son gestionados por un chip CMOS para formar miles de "jaulas" dielectroforéticas, cada una de ellas capaz de capturar y mover una sola célula bajo el control de un software de enrutamiento.

Como las células biológicas tienen propiedades dieléctricas, [15] [16] [17] la dielectroforesis tiene muchas aplicaciones biológicas y médicas. Se han creado instrumentos capaces de separar células cancerosas de células sanas [18] [19] [20] [21] así como de aislar células individuales de muestras forenses mixtas. [22] Se han separado plaquetas de sangre completa con un separador de células activado por DEP . [23]

La DEP ha hecho posible caracterizar y manipular partículas biológicas como células sanguíneas , células madre , neuronas , células β pancreáticas , ADN , cromosomas , proteínas y virus . La DEP se puede utilizar para separar partículas con diferentes polarizabilidades de signo a medida que se mueven en diferentes direcciones a una frecuencia dada del campo de CA aplicado. La DEP se ha aplicado para la separación de células vivas y muertas, con las células vivas restantes aún viables después de la separación [24] o para forzar el contacto entre células individuales seleccionadas para estudiar la interacción célula-célula. [25] La DEP se ha utilizado para separar cepas de bacterias y virus. [26] [27] La ​​DEP también se puede utilizar para detectar la apoptosis poco después de la inducción del fármaco midiendo los cambios en las propiedades electrofisiológicas. [28]

Como herramienta de caracterización celular

La DEP se utiliza principalmente para caracterizar células midiendo los cambios en sus propiedades eléctricas. Para ello, existen muchas técnicas para cuantificar la respuesta dielectroforética, ya que no es posible medir directamente la fuerza DEP. Estas técnicas se basan en medidas indirectas, obteniendo una respuesta proporcional de la fuerza y ​​la dirección de la fuerza que necesita ser escalada al espectro del modelo. Por lo tanto, la mayoría de los modelos solo consideran el factor Clausius-Mossotti de una partícula. Las técnicas más utilizadas son las mediciones de la tasa de recolección: esta es la técnica más simple y más utilizada: los electrodos se sumergen en una suspensión con una concentración conocida de partículas y se cuentan las partículas que se recolectan en el electrodo; [29] mediciones de cruce: la frecuencia de cruce entre DEP positiva y negativa se mide para caracterizar partículas: esta técnica se utiliza para partículas más pequeñas (por ejemplo, virus), que son difíciles de contar con la técnica anterior; [30] mediciones de velocidad de partículas: esta técnica mide la velocidad y la dirección de las partículas en un gradiente de campo eléctrico; [31] Medición de la altura de levitación: la altura de levitación de una partícula es proporcional a la fuerza DEP negativa que se aplica. Por lo tanto, esta técnica es buena para caracterizar partículas individuales y se utiliza principalmente para partículas más grandes, como células. [32] Detección de impedancia : las partículas que se acumulan en el borde del electrodo tienen una influencia en la impedancia de los electrodos; este cambio se puede monitorear para cuantificar la DEP. [33] Para estudiar poblaciones más grandes de células, las propiedades se pueden obtener analizando los espectros dielectroforéticos. [14]

Implementación

Geometrías de electrodos

Al principio, los electrodos se hacían principalmente de cables o láminas de metal. Hoy en día, el campo eléctrico en DEP se crea por medio de electrodos que minimizan la magnitud del voltaje necesario. Esto ha sido posible utilizando técnicas de fabricación como la fotolitografía, la ablación láser y el modelado de haces de electrones. [34] Estos pequeños electrodos permiten el manejo de pequeñas biopartículas. Las geometrías de electrodos más utilizadas son isométrica, polinómica, interdigitada y de barra cruzada. La geometría isométrica es eficaz para la manipulación de partículas con DEP, pero las partículas repelidas no se acumulan en áreas bien definidas y, por lo tanto, la separación en dos grupos homogéneos es difícil. La polinómica es una nueva geometría que produce diferencias bien definidas en regiones de fuerzas altas y bajas y, por lo tanto, las partículas podrían ser recolectadas por DEP positivo y negativo. Esta geometría de electrodos mostró que el campo eléctrico era más alto en la mitad de los espacios entre electrodos. [35] La geometría interdigitada comprende dedos de electrodos alternados de polaridades opuestas y se utiliza principalmente para el atrapamiento y análisis dielectroforético. La geometría de barras transversales es potencialmente útil para redes de interconexiones. [36]

Electrodos de pozo DEP

Estos electrodos se desarrollaron [37] para ofrecer una alternativa de alto rendimiento y bajo costo a las estructuras de electrodos convencionales para DEP. En lugar de utilizar métodos fotolitográficos u otros enfoques de microingeniería, los electrodos de pozo DEP se construyen apilando capas conductoras y aislantes sucesivas en un laminado, después de lo cual se perforan múltiples "pozos" a través de la estructura. Si uno examina las paredes de estos pozos, las capas aparecen como electrodos entrelazados que corren continuamente alrededor de las paredes del tubo. Cuando se conectan capas conductoras alternas a las dos fases de una señal de CA, un gradiente de campo formado a lo largo de las paredes mueve las células por DEP. [38]

Los pocillos DEP se pueden utilizar de dos formas: para análisis o separación. [39] En la primera, las propiedades dielectroforéticas de las células se pueden controlar mediante mediciones de absorción de luz : la DEP positiva atrae las células a la pared del pocillo, por lo que cuando se prueba el pocillo con un haz de luz, la intensidad de la luz aumenta a través del pocillo. Lo opuesto es cierto para la DEP negativa, en la que el haz de luz se oscurece por las células. Alternativamente, el enfoque se puede utilizar para construir un separador, donde las mezclas de células se fuerzan a pasar a través de un gran número (>100) de pocillos en paralelo; las que experimentan DEP positiva quedan atrapadas en el dispositivo mientras que el resto se elimina. Apagar el campo permite la liberación de las células atrapadas en un contenedor separado. La naturaleza altamente paralela del enfoque significa que el chip puede clasificar las células a velocidades mucho más altas, comparables a las utilizadas por MACS y FACS .

Este enfoque ofrece muchas ventajas sobre los dispositivos convencionales basados ​​en la fotolitografía, pero reduce los costes, aumenta la cantidad de muestra que se puede analizar simultáneamente y simplifica el movimiento de las células, que se reduce a una sola dimensión (las células solo pueden moverse radialmente hacia el centro del pocillo o alejándose de él). Los dispositivos fabricados para utilizar el principio de pocillo DEP se comercializan bajo la marca DEPtech.

Fraccionamiento de flujo de campo por dielectroforesis

La utilización de la diferencia entre las fuerzas dielectroforéticas ejercidas sobre diferentes partículas en campos eléctricos no uniformes se conoce como separación DEP. La explotación de las fuerzas DEP se ha clasificado en dos grupos: migración DEP y retención DEP. La migración DEP utiliza fuerzas DEP que ejercen signos opuestos de fuerza sobre diferentes tipos de partículas para atraer algunas de las partículas y repeler otras. [40] La retención DEP utiliza el equilibrio entre las fuerzas DEP y de flujo de fluido. Las partículas que experimentan fuerzas DEP repulsivas y atractivas débiles son eluidas por el flujo de fluido, mientras que las partículas que experimentan fuerzas DEP atractivas fuertes quedan atrapadas en los bordes del electrodo contra el arrastre del flujo. [41]

El fraccionamiento de flujo de campo por dielectroforesis (DEP-FFF), introducido por Davis y Giddings, [42] es una familia de métodos de separación similares a la cromatografía. En DEP-FFF, las fuerzas DEP se combinan con el flujo de arrastre para fraccionar una muestra de diferentes tipos de partículas. [41] [43] [44] [45] [46] [47] Las partículas se inyectan en un flujo portador que pasa a través de la cámara de separación, con una fuerza de separación externa (una fuerza DEP) que se aplica perpendicular al flujo. Por medio de diferentes factores, como la difusión y los efectos estéricos, hidrodinámicos, dieléctricos y otros, o una combinación de ellos, las partículas (<1 μm de diámetro) con diferentes propiedades dieléctricas o difusivas alcanzan diferentes posiciones alejadas de la pared de la cámara, que, a su vez, exhiben un perfil de concentración característico diferente. Las partículas que se alejan más de la pared alcanzan posiciones más altas en el perfil de velocidad parabólica del líquido que fluye a través de la cámara y se eluirá de la cámara a un ritmo más rápido.

Dielectroforesis óptica

El uso de materiales fotoconductores (por ejemplo, en dispositivos de laboratorio en chip) permite la inducción localizada de fuerzas dielectroforéticas mediante la aplicación de luz. Además, se puede proyectar una imagen para inducir fuerzas en un área de iluminación con patrones, lo que permite algunas manipulaciones complejas. Al manipular células vivas, la dielectroforesis óptica proporciona una alternativa no dañina a las pinzas ópticas , ya que la intensidad de la luz es aproximadamente 1000 veces menor. [48]

Referencias

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