El condicionamiento de parpadeo ( EBC ) es una forma de condicionamiento clásico que se ha utilizado ampliamente para estudiar las estructuras neuronales y los mecanismos que subyacen al aprendizaje y la memoria . El procedimiento es relativamente simple y generalmente consiste en emparejar un estímulo auditivo o visual (el estímulo condicionado (CS)) con un parpadeo que provoca un estímulo incondicionado (EE. UU.) (por ejemplo, una leve bocanada de aire en la córnea o una descarga leve). Los organismos ingenuos inicialmente producen una respuesta refleja e incondicionada (RU) (p. ej., parpadeo o extensión de la membrana nictitante) que sigue al inicio de la ecografía. Después de muchos emparejamientos CS-US, se forma una asociación tal que se produce un parpadeo aprendido o respuesta condicionada (CR) que precede al inicio de la US. [1] La magnitud del aprendizaje generalmente se mide por el porcentaje de todas las pruebas emparejadas CS-US que resultan en una RC. En condiciones óptimas, los animales bien entrenados producen un alto porcentaje de CR (>90%). Las condiciones necesarias y los mecanismos fisiológicos que gobiernan el aprendizaje de CR mediante parpadeo se han estudiado en muchas especies de mamíferos , incluidos ratones, ratas, cobayas, conejos, hurones, gatos y humanos. Históricamente, los conejos han sido los sujetos de investigación más populares.
El orden en el que se presentan los estímulos es un factor importante en todas las formas de condicionamiento clásico . El condicionamiento directo describe un formato de presentación en el que el CS precede al EE.UU. en el tiempo. Es decir, desde la perspectiva del sujeto de investigación, experimentar los EE. UU. depende de haber experimentado la EC. La EBC suele realizarse de esta manera, aunque no siempre. Otras contingencias de estímulo incluyen el condicionamiento hacia atrás , en el que el EI aparece antes que el EC, y el condicionamiento simultáneo, en el que el EC y el EI se presentan al mismo tiempo. En cualquier caso, el tiempo entre el inicio de la CS y el inicio de la US es el intervalo entre estímulos (ISI). Los animales suelen ser entrenados con un ISI más corto que los humanos, lo que puede dificultar las comparaciones entre especies. [2]
En el EBC retardado, el inicio del CS precede al inicio del US y los dos estímulos se superponen y coterminan, con los estímulos convergiendo en la corteza cerebelosa y el núcleo interpositus. [3] En el EBC de seguimiento, el CS precede al EE. UU. y hay un período libre de estímulo (intervalo de seguimiento) entre la compensación del CS y el inicio del EE. UU. Si bien ambos procedimientos requieren el cerebelo , el procedimiento de rastreo también requiere el hipocampo y la corteza prefrontal medial. [4] [5]
Cuando se realiza una ecografía en la córnea del ojo, la información sensorial se transporta al núcleo del trigémino y se transmite tanto directa como indirectamente (a través de la formación reticular ) a los núcleos motores del abducens accesorio y abducens (ver Núcleo de los nervios craneales ). La producción de estos núcleos controla varios músculos oculares que trabajan sinérgicamente para producir una respuesta de parpadeo incondicionada a la estimulación corneal (revisado por Christian y Thompson, 2003). La actividad del electromiograma (EMG) del músculo orbicular de los párpados , que controla el cierre del párpado, se considera el componente más destacado y sensible del parpadeo (Lavond et al., 1990) y, por lo tanto, es la variable dependiente derivada del comportamiento más común en el parpadeo. Estudios de EBC.
El núcleo del trigémino también envía proyecciones eferentes a la oliva inferior (IO), y esto representa la vía de EE. UU. para la EBC. La región crítica del IO para el condicionamiento del parpadeo es la oliva accesoria dorsal (Brodal, 1981), y las fibras trepadoras (CF) de esta región envían información sobre el EE. UU. al cerebelo (Brodal, Walberg y Hoddevik, 1975; Thompson, 1989). . Las fibras trepadoras finalmente se proyectan tanto a los núcleos cerebelosos profundos como a las células de Purkinje (PC) en la corteza cerebelosa .
Los núcleos pontinos (PN) pueden soportar diferentes modalidades de CS (tono auditivo, luz, etc.) para la EBC, ya que reciben proyecciones de los sistemas auditivo, visual, somatosensorial y de asociación (Glickstein et al., 1980; Brodal, 1981; Schmahmann & Pandya, 1989; 1991; 1993). Cuando el CS es un tono, la información auditiva se recibe a través de los núcleos cocleares (Steinmetz y Sengelaub, 1992). Las PN dan lugar a axones de fibras musgosas (MF) que transportan información relacionada con el CS (Steinmetz et al., 1987; Lewis et al., 1987; Thompson et al., 1997) al cerebelo a través del pedúnculo cerebeloso medio , y terminan tanto en los núcleos cerebelosos como en las células granulares (GR) de la corteza cerebelosa (Steinmetz y Sengelaub, 1992). Las células granulares dan lugar a axones de fibras paralelas (PF) que hacen sinapsis con las PC.
Dos sitios cerebelosos de convergencia CS-US son 1) células de la región nuclear profunda del cerebelo y 2) PC de la corteza. [6] Además de recibir entradas convergentes de CS y US a través de PN e IO, respectivamente, las células de los núcleos cerebelosos reciben entradas inhibidoras GABAérgicas de las PC de la corteza cerebelosa. La salida del núcleo interpositus incluye proyecciones al núcleo rojo , y el núcleo rojo envía proyecciones a los núcleos facial y abducens. Estos núcleos suministran el componente de salida motor del parpadeo reflexivo. Por lo tanto, además de ser un sitio de convergencia de estímulos, los núcleos profundos también son la estructura de salida del cerebelo.
David A. McCormick , como estudiante de posgrado del profesor Richard F. Thompson, identificó inicialmente el cerebelo como la estructura esencial para aprender y ejecutar RC de parpadeo. Algunos científicos piensan que el núcleo interpuesto es el sitio crítico para aprender, retener y ejecutar la respuesta condicionante del parpadeo.
La primera evidencia del papel del cerebelo en la EBC provino de McCormick et al. (1981). Descubrieron que una lesión cerebelosa unilateral que incluía tanto la corteza como los núcleos profundos abolía permanentemente las CR. En estudios posteriores, se determinó que las lesiones del interposito lateral y de los núcleos dentados mediales eran suficientes para prevenir la adquisición de CR en animales no expuestos (Lincoln et al., 1982) y abolieron las CR en animales bien entrenados (McCormick y Thompson, 1984). . [7] Finalmente, el uso de lesiones con ácido kaínico , que destruyen los cuerpos celulares neuronales y preservan las fibras que pasan, proporcionó evidencia de una región altamente localizada de células nucleares cerebelosas que son esenciales para aprender y realizar RC (Lavond et al., 1985). La población de células críticas para la EBC parece estar restringida a un área de ~ 1 mm3 de INP anterior dorsolateral ipsilateral al ojo condicionado. Las lesiones en esta área de INP dan como resultado una incapacidad para adquirir CR de parpadeo en animales ingenuos. Además, es destacable la permanencia del efecto de lesión localizada. En animales bien entrenados, las CR abolidas como resultado de una lesión no se vuelven a adquirir, incluso después de un entrenamiento extenso que abarca más de 8 meses (Steinmetz et al., 1992). Estos resultados demuestran que una región altamente localizada del cerebelo debe estar intacta para que se produzca el aprendizaje de CR en EBC.
La inactivación reversible del INP ha proporcionado más evidencia de su papel en la CE. Los métodos utilizados para inactivar temporalmente el tejido nervioso incluyen el uso de una sonda de enfriamiento (<10 °C) y la infusión local de muscimol o lidocaína . Estos métodos son ventajosos principalmente porque el experimentador puede esencialmente activar y desactivar el tejido neutro, per se . El efecto de cada uno de estos protocolos de inactivación sobre el aprendizaje y la ejecución de CR se ha probado en todo el cerebelo y las estructuras asociadas del tronco encefálico. Cuando se aplica al INP, la inactivación temporal previene por completo el aprendizaje de los CR en animales no expuestos, y el aprendizaje ocurre normalmente durante el entrenamiento posterior a la inactivación (Clark et al., 1992; Krupa et al., 1993; Nordholm et al., 1993; Krupa & Thompson, 1997). Además, la inactivación del INP en animales bien entrenados da como resultado una depresión completa de la respuesta condicionada, que regresa a niveles estables cuando el INP vuelve a estar en línea (Clark et al., 1992).
Los registros de la actividad neuronal de unidades múltiples del INP de conejo durante el condicionamiento del parpadeo han sido posibles con implantes de electrodos crónicos y han revelado una población de células que se descargan antes del inicio de la CR del parpadeo aprendido y se disparan en un patrón de mayor frecuencia de respuesta que predijo y modeló la forma temporal de la RC conductual (McCormick et al., 1981; 1982; 1983; Thompson, 1983; 1986; Foy et al., 1984; McCormick & Thompson, 1984a; b; Berthier & Moore, 1990; Gould & Steinmetz, 1996). Se encontraron resultados similares en el INP de rata (Freeman & Nicholson, 2000; Stanton & Freemen, 2000; Rogers et al., 2001), lo que demuestra que los circuitos subyacentes para esta forma de aprendizaje pueden conservarse entre especies. Aunque las muestras de actividad de una sola unidad del INP y los núcleos circundantes han revelado una multitud de patrones de respuesta durante la EBC (Tracy, 1995), muchas de las células en el INP dorsolateral anterior aumentan significativamente su velocidad de activación en un patrón temporal preciso que se retrasa. desde el inicio de la CS y precede al inicio de la CR (Foy et al., 1984; Berthier & Moore, 1990). Este patrón de respuesta es indicativo de una estructura que es capaz de codificar el aprendizaje y/o ejecutar respuestas conductuales aprendidas.
Se ha postulado que existen sitios alternativos de plasticidad sináptica críticos para la EBC aguas abajo del cerebelo. Algunos loci propuestos incluyen el núcleo rojo (Tsukahara, Oda y Notsu, 1981), el núcleo trigémino y estructuras asociadas (Desmond y Moore, 1983) o el núcleo motor facial (Woody et al., 1974). Todas estas estructuras han sido descartadas como sitios potenciales de plasticidad críticos para aprender el parpadeo CR (Krupa, Thompson y Thompson, 1993; Clark y Lavond, 1996; Krupa, Weng y Thompson, 1996).
En conjunto, los resultados de los estudios de lesión, inactivación y registro neural parecen demostrar que la porción dorsolateral del núcleo interpositus anterior (INP) del cerebelo, ipsilateral al ojo entrenado, es un sitio esencial para la adquisición y expresión de CR en EBC. Lincoln et al., 1982; Lavond et al., 1984a,b). Sin embargo, estudios recientes (Nilaweera et al., 2006) encontraron que el bloqueo temporal de la producción cerebelosa impedía la adquisición normal de respuestas condicionadas. Los autores concluyeron que esta forma de aprendizaje asociativo en el sistema de parpadeo del conejo requiere un aprendizaje extracerebeloso y/o un aprendizaje cerebeloso que depende del funcionamiento de los circuitos de retroalimentación cerebelosa.
Dos áreas de la corteza que se sabe que están involucradas en el condicionamiento del parpadeo son el lóbulo HVI (Lavond et al., 1987; Lavond y Steinmetz, 1989; Yeo y Hardiman, 1992) y el lóbulo anterior ((ANT) García, Steele y Mauk. , 1999). La importancia de la corteza cerebelosa en la EBC, en relación con el INP, es un tema de debate en la comunidad científica.
Varios estudios han intentado evaluar el papel de la corteza cerebelosa en el aprendizaje de RC al parpadear, y los primeros estudios se centraron en grandes lesiones por aspiración de la corteza cerebelosa. Lavond y Steinmetz (1989) eliminaron completamente los lóbulos HVI/HVIIa y porciones significativas de ANT, preservando el INP, y encontraron déficits de adquisición significativos. En comparación con los controles, los animales lesionados tardaron siete veces más en alcanzar el criterio de aprendizaje. Los animales con lesiones corticales finalmente alcanzaron porcentajes significativos de RC, pero las RC fueron de baja amplitud y mal sincronizadas. Finalmente, las lesiones grandes de la corteza cerebelosa después del aprendizaje no anulan las RC aprendidas (Lavond et al., 1987). Un factor común en todos estos estudios de ablación cortical fue que se salvaron porciones de la corteza; permitiendo suponer que otras áreas de la corteza estaban compensando la pérdida de tejido.
El condicionamiento clásico de una cepa de ratón mutante deficiente en células de Purkinje ayudó a determinar en qué medida las regiones preservadas de la corteza cerebelosa compensaban las regiones lesionadas en los estudios mencionados anteriormente. Estos ratones nacen con PC que mueren después de aproximadamente 3 semanas de vida. Debido a que las PC son la única neurona de salida de la corteza, este modelo lesiona efectivamente toda la corteza cerebelosa. Los resultados del acondicionamiento fueron similares a los de los ratones con aspiración cortical. Los ratones tardaron mucho más en producir CR y el momento y la ganancia de la respuesta se distorsionaron (Chen et al., 1996). Por lo tanto, aunque los déficits de aprendizaje de CR en el parpadeo están asociados con lesiones de la corteza cerebelosa, la estructura no parece, en última instancia, ser esencial para el aprendizaje o la retención de CR.
Los resultados de los estudios de inactivación cortical cerebelosa son similares a los informados para los estudios de lesiones. Por ejemplo, Krupa (1993) inactivó el lóbulo HVI con el agonista del receptor GABA A Muscimol y encontró déficits de adquisición significativos, pero los animales finalmente aprendieron. Clark y cols. (1997) replicaron estos resultados con una sonda de enfriamiento en HVI. Attwell, Rahman y Yeo (2001) descubrieron una alteración similar con la inactivación del HVI. Infundieron el antagonista del receptor AMPA CNQX en HVI durante el entrenamiento de adquisición y descubrieron que los conejos infundidos con CNQX no aprendieron el CR de parpadeo. Sin embargo, las infusiones de CNQX posteriores a la adquisición no afectaron la retención. Estos resultados son desconcertantes, dado que los animales finalmente aprendieron la RC de parpadeo en todos los demás estudios de inactivación y lesión cortical cerebelosa. Una razón por la cual este efecto es tan fuerte puede ser que Attwell et al., (2001) entrenaron animales durante sólo 4 días en un ISI que está fuera de un rango conocido como óptimo para el aprendizaje [150–300 ms es un CS óptimo]. El intervalo US y la magnitud del aprendizaje disminuyen a medida que aumenta el ISI (Schneiderman y Gormezano, 1964; Smith, Coleman y Gormezano, 1969)].
Los estudios de registro electrofisiológico de la corteza cerebelosa han ayudado a comprender mejor el papel que desempeñan las PC en el proceso de aprendizaje de CR del parpadeo. McCormick y Thompson (1984b) registraron la actividad de PC durante el entrenamiento de parpadeo y encontraron poblaciones de células que se descargaban en un patrón aparentemente relacionado con el CR conductual, mientras que otras poblaciones de PC se descargaban en patrones que coincidían con la presentación del CS o del US. Berthier y Moore (1986) encontraron resultados similares con el registro de una sola unidad de PC en el lóbulo HVI. Descubrieron que las poblaciones de neuronas se activan en relación con diversos aspectos del entrenamiento de parpadeo, incluida la presentación de CS y EE. UU. y la ejecución de CR. (Berthier y Moore, 1986; Gould y Steinmetz, 1996). Recientemente, se ha encontrado en ANT una actividad de PC similar relacionada con estímulos y respuestas (Green y Steinmetz, 2005). Finalmente, los registros electrofisiológicos de las PC en HVI y ANT han revelado una diferencia en las respuestas generales de la población de las PC. La mayoría de las PC muestran patrones de actividad excitadores durante el condicionamiento del parpadeo en HVI (Berthier y Moore, 1986; Gould y Steinmetz, 1996; Katz y Steinmetz, 1997), y patrones de actividad inhibidores en ANT (Green y Steinmetz, 2005).
En un estudio de grabación de una sola unidad en el que se demostró que las células de Purkinje individuales estaban ubicadas en el área que controlaba los parpadeos y recibían entradas de fibras trepadoras en presentaciones de EE. UU., solo se encontraron respuestas inhibidoras. [8] En un estudio reciente de células de Purkinje caracterizadas de manera similar que fueron seguidas durante más de quince horas, se encontró que las presentaciones repetidas de CS y US causaron el desarrollo gradual de una pausa en la activación de las células de Purkinje. [9] Esta respuesta de pausa, llamada CR de células de Purkinje, también se obtuvo cuando se utilizó estimulación directa de fibras musgosas como CS y estimulación directa de fibras trepadoras como EE. UU. Las presentaciones no apareadas de CS y US provocaron la extinción de la célula CR de Purkinje. Cuando se reintrodujeron las presentaciones emparejadas después de la extinción, las CR de las células de Purkinje reaparecieron rápidamente, reflejando el fenómeno de "ahorro" demostrado a nivel de comportamiento. Las CR de células de Purkinje también se cronometraron de forma adaptativa.
Se ha demostrado que los núcleos cerebelosos profundos inhiben la oliva inferior y esta inhibición probablemente cumple una función de control de retroalimentación negativa. [10] A medida que avanza el aprendizaje, la oliva se inhibe y se ha demostrado que esta inhibición tiene propiedades temporales que la hacen ideal para servir como señal de retroalimentación para controlar el aprendizaje. La estimulación de esta vía durante las presentaciones CS-US emparejadas provoca la extinción. Los registros de las células de Purkinje muestran que la aceituna está deprimida durante la RC de las células de Purkinje. [11]
En conjunto, los resultados de los estudios de lesión, inactivación y registro neuronal parecen demostrar que la corteza cerebelosa no es esencial para el aprendizaje o la retención básica de RC en el parpadeo, pero que contribuciones significativas de la corteza subyacen al aprendizaje normal.
Se plantea la hipótesis de que la depresión a largo plazo (LTD) en la sinapsis PF-PC tiene consecuencias funcionales significativas para el aprendizaje de la CR conductual en EBC (Ito, 1984). Por ejemplo, como resultado del entrenamiento, las células INP se descargan antes de la ejecución de la RC y se activan en un patrón de mayor frecuencia de respuesta que predice la forma temporal de la RC conductual (McCormick y Thompson, 1984). Este patrón de actividad indica claramente que el INP es capaz de generar una respuesta condicionada. Las células de Purkinje de la corteza cerebelosa inhiben tónicamente las células nucleares profundas. Por lo tanto, una disminución mediada por LTD en la actividad de PC en el momento apropiado durante un intervalo CS-US podría liberar al INP de la inhibición tónica y permitir la ejecución de una CR. Un aumento en la actividad de PC podría tener el efecto contrario, prohibiendo o limitando la ejecución de CR. Se ha planteado la hipótesis de que las CR son generadas por el INP como resultado de la liberación de la inhibición de la PC (es decir, Perrett et al., 1993).