El agua doblemente marcada es agua en la que tanto el hidrógeno como el oxígeno han sido reemplazados parcial o totalmente (es decir, marcados ) con un isótopo poco común de estos elementos para fines de rastreo.
En la práctica, por razones prácticas y de seguridad, casi todas las aplicaciones recientes del método del "agua doblemente marcada" (DLW) utilizan agua marcada con formas pesadas pero no radiactivas de cada elemento ( deuterio , 2 H; y oxígeno-18 , 18 O). En teoría, se podrían utilizar isótopos pesados radiactivos de los elementos para dicho marcado; este fue el caso en muchas de las primeras aplicaciones del método. [ cita requerida ]
En particular, la DLW se puede utilizar como método para medir la tasa metabólica diaria promedio de un organismo durante un período de tiempo (a menudo también llamada tasa metabólica de campo o FMR, en animales no humanos). Esto se hace administrando una dosis de DLW y luego midiendo las tasas de eliminación de 2 H y 18 O en el sujeto a lo largo del tiempo (a través de un muestreo regular de concentraciones de isótopos pesados en el agua corporal, mediante el muestreo de saliva, orina o sangre). Se requieren al menos dos muestras: una muestra inicial (después de que los isótopos hayan alcanzado el equilibrio en el cuerpo) y una segunda muestra algún tiempo después. El tiempo entre estas muestras depende del tamaño del animal. En animales pequeños, el período puede ser tan corto como 24 horas; en animales más grandes (como los humanos adultos), el período puede ser tan largo como 14 días.
El método fue inventado en la década de 1950 por Nathan Lifson y sus colegas [1] [2] en la Universidad de Minnesota. Sin embargo, su uso estuvo restringido a animales pequeños hasta la década de 1980 debido al alto costo del oxígeno-18. Los avances en espectrometría de masas durante la década de 1970 y principios de la de 1980 redujeron la cantidad de isótopo necesario, lo que hizo posible aplicar el método a animales más grandes, incluidos los humanos. [3] La primera aplicación a humanos fue en 1982, [4] por Dale Schoeller , más de 25 años después de que se descubriera inicialmente el método. Un resumen completo de la técnica se proporciona en un libro del biólogo británico John Speakman . [5]
La técnica mide la producción de dióxido de carbono de un sujeto durante el intervalo entre la primera y la última muestra de agua corporal. El método depende de los detalles del metabolismo del carbono en nuestros cuerpos. Cuando la respiración celular descompone las moléculas que contienen carbono para liberar energía, se libera dióxido de carbono como subproducto. Los átomos de oxígeno en el CO2 existen en equilibrio con los isótopos de oxígeno en el agua corporal. [6] Por lo tanto, si el oxígeno en el agua está marcado con 18 O, entonces el CO2 producido por la respiración contendrá oxígeno marcado. Además, a medida que el CO2 viaja desde el sitio de la respiración a través del citoplasma de una célula, a través de los fluidos intersticiales, hacia el torrente sanguíneo y luego a los pulmones, parte de él se convierte reversiblemente en bicarbonato. Entonces, después de consumir agua marcada con 18 O, el 18 O se equilibra con el bicarbonato del cuerpo y el depósito de dióxido de carbono disuelto (a través de la acción de la enzima anhidrasa carbónica ). A medida que se exhala dióxido de carbono, el 18 O se pierde del cuerpo. Esto fue descubierto por Lifson en 1949. [7] Sin embargo, el 18 O también se pierde a través de la pérdida de agua corporal (como la orina y la evaporación de líquidos). Sin embargo, el deuterio (la segunda etiqueta en el agua doblemente etiquetada) se pierde solo cuando se pierde agua corporal. Por lo tanto, la pérdida de deuterio en el agua corporal a lo largo del tiempo se puede utilizar para compensar matemáticamente la pérdida de 18 O por la vía de pérdida de agua. Esto deja solo la pérdida neta restante de 18 O en dióxido de carbono. Esta medición de la cantidad de dióxido de carbono perdido es una excelente estimación de la producción total de dióxido de carbono. Una vez que se conoce esto, la tasa metabólica total se puede estimar a partir de suposiciones simplificadas sobre la relación entre el oxígeno utilizado en el metabolismo (y, por lo tanto, el calor generado) y el dióxido de carbono eliminado (ver cociente respiratorio ). Este cociente se puede medir de otras formas y casi siempre tiene un valor entre 0,7 y 1,0, y para una dieta mixta suele ser de aproximadamente 0,8.
En términos sencillos:
A partir de la pérdida de deuterio, sabemos qué cantidad de agua marcada salió del cuerpo en forma de agua. Y, dado que la concentración de 18 O en el agua del cuerpo se mide después de administrar la dosis de marcado, también sabemos qué cantidad de oxígeno marcado salió del cuerpo en el agua. (Una visión más simple es que la relación de deuterio a 18 O en el agua corporal es fija, por lo que la tasa de pérdida total de deuterio del cuerpo multiplicada por esta relación, da inmediatamente la tasa de pérdida de 18 O en el agua). La medición de la dilución de 18 O con el tiempo da la pérdida total de este isótopo por todas las vías (por agua y respiración). Dado que se mide la relación de 18 O con el oxígeno total del agua en el cuerpo, podemos convertir la pérdida de 18 O en la respiración en oxígeno total perdido del depósito de agua del cuerpo a través de la conversión a dióxido de carbono. La cantidad de oxígeno que salió del cuerpo en forma de CO2 es la misma que el CO2 producido por el metabolismo, ya que el cuerpo solo produce CO2 por esta vía. La pérdida de CO2 nos indica la energía producida, si conocemos o podemos estimar el cociente respiratorio (relación entre el CO2 producido y el oxígeno utilizado).
El DLW puede administrarse por inyección o por vía oral (la vía habitual en humanos). Dado que los isótopos se diluirán en el agua corporal, no es necesario administrarlos en un estado de alta pureza isotópica, no es necesario emplear agua en la que todos o incluso la mayoría de los átomos sean átomos pesados, o incluso empezar con agua que esté doblemente marcada. Tampoco es necesario administrar exactamente un átomo de 18 O por cada dos átomos de deuterio. En la práctica, esta cuestión está regida por la economía de la compra de agua enriquecida con 18 O y la sensibilidad del equipo de espectrografía de masas disponible.
En la práctica, las dosis de agua doblemente marcada para el trabajo metabólico se preparan simplemente mezclando una dosis de óxido de deuterio ( agua pesada ) ( 90 a 99%) con una segunda dosis de H2O , que es agua que se ha enriquecido por separado con 18O (aunque normalmente no a un nivel alto, ya que hacerlo sería costoso e innecesario para este uso), pero que por lo demás contiene hidrógeno normal. La muestra de agua mezclada contiene entonces ambos tipos de átomos pesados, en un grado mucho mayor que el agua normal, y ahora está "doblemente marcada". El libre intercambio de hidrógenos entre las moléculas de agua (a través de la ionización normal) en agua líquida garantiza que los depósitos de oxígeno e hidrógeno en cualquier muestra de agua (incluido el depósito de agua del cuerpo) se equilibrarán por separado en poco tiempo con cualquier dosis de isótopos pesados añadidos.
El método del agua doblemente marcada es particularmente útil para medir la tasa metabólica media ( tasa metabólica de campo ) durante períodos de tiempo relativamente largos (unos días o semanas), en sujetos para los que otros tipos de mediciones calorimétricas directas o indirectas de la tasa metabólica serían difíciles o imposibles. Por ejemplo, la técnica puede medir el metabolismo de animales en estado salvaje, con problemas técnicos relacionados principalmente con cómo administrar la dosis de isótopo y recolectar varias muestras de agua corporal en momentos posteriores para verificar la eliminación diferencial de isótopos.
La mayoría de los estudios con animales implican capturar a los animales en cuestión e inyectarlos, y luego retenerlos durante un período variable antes de que se haya tomado la primera muestra de sangre. Este período depende del tamaño del animal en cuestión y varía entre 30 minutos para animales muy pequeños y 6 horas para animales mucho más grandes. Tanto en animales como en humanos, la prueba es más precisa si se ha realizado una única determinación del cociente respiratorio para el organismo que come la dieta estándar en el momento de la medición, ya que este valor cambia relativamente poco (y más lentamente) en comparación con los cambios mucho mayores de la tasa metabólica relacionados con la termorregulación y la actividad.
Debido a que los isótopos pesados de hidrógeno y oxígeno utilizados en la medición estándar de DLW no son radiactivos y tampoco tóxicos en las dosis utilizadas (ver agua pesada ), la medición de la tasa metabólica media mediante DLW se ha utilizado ampliamente en voluntarios humanos, e incluso en bebés [8] y mujeres embarazadas. [9] La técnica se ha utilizado en más de 200 especies de animales salvajes (principalmente aves, mamíferos y algunos reptiles). Se han revisado las aplicaciones del método a animales. [10] [11] Un artículo de 2021 resumió los resultados de más de 6400 mediciones utilizando la técnica en humanos de entre 8 días y 96 años de edad. [12]
El DLW ( 2 H 2 18 O) también se puede utilizar para hielo inusualmente cálido y agua inusualmente densa, ya que tiene un punto de fusión más alto y es más denso que el agua ligera o lo que normalmente se entiende por "agua pesada" ( 2 H 2 16 O). El 2 H 2 18 O se funde a 4,00~4,04 °C (39,2~39,27 °F) y el líquido alcanza su densidad máxima de 1,21684~1,21699 g/cm 3 a 11,43~11,49 °C (52,57~52,68 °F). [13]