La zimografía con catepsina es una técnica para cuantificar la actividad enzimática de la familia de catepsinas de cisteína proteasas. Se basa en SDS-PAGE mediante el cual las muestras analizadas para determinar la actividad de catepsina se cargan en un gel de poliacrilamida y luego se separan por peso molecular. La gelatina está incrustada en el propio gel, proporcionando un sustrato para que las enzimas se hidrolicen.
Si bien las proformas de catepsinas son generalmente estables, una vez activadas, las proteasas como la catepsina K son vulnerables a la inactivación en ambientes de pH neutro. Esta pérdida de actividad complica la detección de estas enzimas. La zimografía, a través de su alta sensibilidad y naturaleza múltiple, permite la distinción simultánea entre múltiples catepsinas. Se pueden dilucidar cantidades muy pequeñas de actividad enzimática y es capaz de resolver un femtomol de actividad de catepsina K.
Las muestras de tejido se lisan en un tampón suplementado con leupeptina para mantener la actividad enzimática. Las muestras se estandarizan para la concentración de proteínas y luego se cargan en un gel de poliacrilamida para SDS-PAGE. Una vez completada la separación de proteínas por peso molecular, el gel se incuba en un tampón renaturalizante para restaurar la actividad enzimática. Durante la carga, se utilizó un tampón no reductor para preservar los enlaces disulfuro de proteínas. Después del período de renaturalización, el gel se incuba en tampón de ensayo para permitir que las catepsinas ahora activas proteolicen la gelatina impregnada en el gel. Este proceso se lleva a cabo durante la noche. Al día siguiente, se analiza el gel en busca de regiones de degradación de gelatina mediante tinción con azul de Coomassie. Se notan parches de gel que ya no son azules después de un lavado decolorante. Luego, estas bandas se correlacionan con sus respectivos pesos moleculares para identificar qué catepsinas estaban activas en la muestra.
Detección de catepsina K mediante zimografía [1]
Técnicas zimográficas para la detección de catepsinas K, L, S y V [2]
Zimografía para la detección de cáncer con catepsinas como biomarcadores [3]
