La transferencia de energía de fluorescencia resuelta en el tiempo ( TR-FRET ) es la combinación práctica de la fluorometría resuelta en el tiempo (TRF) con la transferencia de energía de resonancia de Förster (FRET) que ofrece una herramienta poderosa para los investigadores del descubrimiento de fármacos. TR-FRET combina el aspecto de bajo fondo de TRF con el formato de ensayo homogéneo de FRET. El ensayo resultante proporciona un aumento en la flexibilidad, confiabilidad y sensibilidad además de un mayor rendimiento y menos resultados falsos positivos/falsos negativos. FRET involucra dos fluoróforos , un donante y un aceptor. [1] La excitación del donante por una fuente de energía (por ejemplo, lámpara de flash o láser) produce una transferencia de energía al aceptor si los dos están dentro de una proximidad dada entre sí. El aceptor a su vez emite luz en su longitud de onda característica.
El aspecto FRET de la tecnología está impulsado por varios factores, incluyendo la superposición espectral y la proximidad de los fluoróforos involucrados, donde la transferencia de energía ocurre solo cuando la distancia entre el donante y el aceptor es lo suficientemente pequeña. En la práctica, los sistemas FRET se caracterizan por el radio de Förster (R 0 ): la distancia entre los fluoróforos en la que la eficiencia FRET es del 50%. Para muchos pares de fluoróforos FRET, R 0 se encuentra entre 20 y 90 Å, dependiendo del aceptor utilizado y las disposiciones espaciales de los fluoróforos dentro del ensayo. [1] A través de la medición de esta transferencia de energía, las interacciones entre biomoléculas se pueden evaluar acoplando cada socio con una etiqueta fluorescente y detectando el nivel de transferencia de energía. La emisión del aceptor como una medida de la transferencia de energía se puede detectar sin necesidad de separar los componentes del ensayo unidos de los no unidos (por ejemplo, un paso de filtración o lavado), lo que resulta en un tiempo y un costo de ensayo reducidos. [2]
Los ensayos TR-FRET homogéneos de mezcla y lectura ofrecen ventajas sobre otros ensayos de detección biomolecular, como los ensayos de polarización de fluorescencia (FP) o TRF. [3] En los ensayos FP, la fluorescencia de fondo debida a los compuestos de la biblioteca normalmente está despolarizada y la señal de fondo debida a la luz dispersa (por ejemplo, compuestos precipitados) normalmente está polarizada. Dependiendo de la configuración del ensayo, cualquiera de los casos puede conducir a un resultado falso positivo o falso negativo. Sin embargo, debido a que la especie donante utilizada en un ensayo TR-FRET tiene una vida útil fluorescente que es muchos órdenes de magnitud más larga que la fluorescencia de fondo o la luz dispersa, la señal de emisión resultante de la transferencia de energía se puede medir después de que cualquier señal interferente se haya desintegrado por completo. Los ensayos TR-FRET también se pueden formatear para usar concentraciones limitantes de receptor y trazador en exceso (a diferencia de los ensayos FP), lo que puede proporcionar un mayor ahorro de costos. [4] En el caso de los ensayos TRF, se requiere un paso de lavado para eliminar los reactivos fluorescentes no unidos antes de medir la señal de actividad del ensayo. Esto aumenta el uso de reactivos, el tiempo para completar el ensayo y limita la capacidad de miniaturizar el sistema (por ejemplo, convertir de una placa de microtitulación de 384 pocillos a una placa de 1536 pocillos ). [5] Los ensayos TR-FRET aprovechan la proximidad requerida de las especies donadora y aceptora para la generación de la señal.
Además, algunos investigadores prefieren este método porque no depende de materiales radiactivos para generar la señal que se desea detectar, lo que evita tanto los riesgos que supone utilizar los materiales como los costes y la logística que suponen el almacenamiento, el uso y la eliminación. [6]
Aunque la TR-FRET se puede lograr con una variedad de combinaciones de fluoróforos, los metales lantánidos son particularmente útiles. Ciertas aplicaciones de las ciencias de la vida aprovechan las propiedades de fluorescencia únicas de los complejos de iones lantánidos (quelatos o criptatos de Ln(III)). Estos son muy adecuados para esta aplicación debido a sus grandes desplazamientos de Stokes y tiempos de vida de emisión extremadamente largos (de microsegundos a milisegundos) en comparación con los fluoróforos más tradicionales (por ejemplo, fluoresceína, aloficoyanina, ficoeritrina y rodamina). Los fluidos biológicos o sueros que se usan comúnmente en estas aplicaciones de investigación contienen muchos compuestos y proteínas que son naturalmente fluorescentes. Por lo tanto, el uso de la medición de fluorescencia convencional en estado estable presenta serias limitaciones en la sensibilidad del ensayo. Los fluoróforos de larga duración, como los lantánidos, combinados con la detección resuelta en el tiempo (un retraso entre la excitación y la detección de la emisión) minimizan la interferencia de fluorescencia inmediata. Este método (comúnmente conocido como fluorometría resuelta en el tiempo o TRF) involucra dos fluoróforos: un donante y un aceptor. La excitación del fluoróforo donante (en este caso, el complejo iónico de lantánido) por una fuente de energía (por ejemplo, una lámpara de destellos o un láser) produce una transferencia de energía al fluoróforo aceptor si se encuentran dentro de una determinada proximidad entre sí (conocida como radio de Förster). El fluoróforo aceptor a su vez emite luz en su longitud de onda característica. Los dos lantánidos más utilizados en ensayos de ciencias biológicas se muestran a continuación junto con su colorante aceptor correspondiente, así como sus longitudes de onda de excitación y emisión y el desplazamiento de Stokes resultante (separación de las longitudes de onda de excitación y emisión).
Como se indica en la tabla anterior, la transferencia de energía fluorescente del europio a la aloficocianina se puede utilizar de manera resuelta en el tiempo, en particular en ensayos de detección biomolecular. La figura de la derecha muestra la intersección de la emisión del europio con la excitación de la aloficocianina (APC), donde la transferencia de energía ocurre cuando el europio y la APC se acercan a través de interacciones biomoleculares.
Cuando estos dos fluoróforos se juntan mediante una interacción biomolecular, una parte de la energía captada por el europio durante la excitación se libera mediante emisión de fluorescencia a 620 nm, mientras que la energía restante se transfiere al APC. Esta energía es luego liberada por el APC como fluorescencia específica a 665 nm solo mediante FRET con europio.
A través del diseño del ensayo de detección de alto rendimiento , los materiales se mezclan y, si la enzima actúa sobre el péptido, todos los componentes se unirán a sus respectivos objetivos y se producirá FRET. [8]
El instrumento utilizado para medir el ensayo luego retrasa la lectura de la luz emitida por varios cientos de milisegundos después de la luz incidente/excitación (el pulso de energía luminosa suministrado por el instrumento para excitar la molécula donante) para eliminar cualquier "interferencia" entre las señales de excitación y emisión. ("Interferencia" en este caso se refiere a perfiles espectrales superpuestos, que podrían resultar en falsos positivos, falsos negativos o sensibilidad reducida dependiendo del diseño del ensayo. [9] ) Este proceso comprende el aspecto "resuelto en el tiempo" del ensayo.