La secuenciación de semiconductores iónicos es un método de secuenciación de ADN basado en la detección de iones de hidrógeno que se liberan durante la polimerización del ADN . Se trata de un método de "secuenciación por síntesis", durante el cual se construye una cadena complementaria a partir de la secuencia de una cadena molde .
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Un micropocillo que contiene una cadena de ADN molde que se va a secuenciar se llena con una sola especie de desoxirribonucleótido trifosfato (dNTP). Si el dNTP introducido es complementario al nucleótido molde principal , se incorpora a la cadena complementaria en crecimiento. Esto provoca la liberación de un ion hidrógeno que activa un sensor de transistor de efecto de campo sensible a iones (ISFET), que indica que se ha producido una reacción. Si hay repeticiones de homopolímero presentes en la secuencia molde, se incorporarán múltiples moléculas de dNTP en un solo ciclo. Esto conduce a una cantidad correspondiente de hidrógenos liberados y a una señal electrónica proporcionalmente mayor.
Esta tecnología se diferencia de otras tecnologías de secuenciación por síntesis en que no se utilizan nucleótidos ni componentes ópticos modificados . La secuenciación de semiconductores iónicos también puede denominarse secuenciación de torrente iónico, secuenciación mediada por pH, secuenciación de silicio o secuenciación de semiconductores.
La tecnología fue licenciada por DNA Electronics Ltd, [1] [2] desarrollada por Ion Torrent Systems Inc. y fue lanzada en febrero de 2010. [3] Ion Torrent ha comercializado su máquina como un secuenciador rápido, compacto y económico que puede utilizarse en una gran cantidad de laboratorios como una máquina de sobremesa. [4] 454 Life Sciences de Roche se está asociando con DNA Electronics en el desarrollo de una plataforma de secuenciación de semiconductores de alta densidad y lectura prolongada que utiliza esta tecnología. [5]
En la naturaleza, la incorporación de un desoxirribonucleósido trifosfato (dNTP) a una cadena de ADN en crecimiento implica la formación de un enlace covalente y la liberación de pirofosfato y un ion hidrógeno con carga positiva . [1] [3] [6] Un dNTP solo se incorporará si es complementario al nucleótido de plantilla desapareado principal. La secuenciación de semiconductores iónicos explota estos hechos al determinar si se libera un ion hidrógeno al proporcionar una sola especie de dNTP a la reacción.
Los pocillos de un chip semiconductor que contienen muchas copias de una molécula de ADN monocatenario que se va a secuenciar y la ADN polimerasa se llenan secuencialmente con dNTP A, C, G o T no modificados . [3] [7] [8] Si un dNTP introducido es complementario al siguiente nucleótido no apareado en la cadena de plantilla, la ADN polimerasa lo incorpora a la cadena complementaria en crecimiento. [9] Si el dNTP introducido no es complementario, no hay incorporación ni reacción bioquímica. El ion hidrógeno que se libera en la reacción cambia el pH de la solución, lo que se detecta mediante un ISFET. [1] [3] [7] Las moléculas de dNTP no unidas se eliminan antes del siguiente ciclo cuando se introduce una especie de dNTP diferente. [7]
Debajo de la capa de micropocillos hay una capa sensible a los iones, debajo de la cual hay un sensor de iones ISFET. [4] Todas las capas están contenidas dentro de un chip semiconductor CMOS , similar al que se utiliza en la industria electrónica. [4] [10]
Cada chip contiene una serie de micropocillos con detectores ISFET correspondientes. [7] Cada ion de hidrógeno liberado activa el sensor de iones ISFET. La serie de pulsos eléctricos transmitidos desde el chip a una computadora se traduce en una secuencia de ADN, sin necesidad de conversión de señal intermedia. [7] [11] Debido a que los eventos de incorporación de nucleótidos se miden directamente mediante electrónica, se evita el uso de nucleótidos marcados y mediciones ópticas. [4] [10] El procesamiento de señales y el ensamblaje del ADN se pueden realizar a través de software.
La precisión por base lograda en el secuenciador de semiconductores Ion Torrent Ion en febrero de 2011 fue del 99,6 % en base a 50 lecturas de base , con 100 Mb por ejecución. [12] La longitud de lectura en febrero de 2011 fue de 100 pares de bases . [12] La precisión para repeticiones de homopolímero de 5 repeticiones de longitud fue del 98 %. [12] Las versiones posteriores muestran una longitud de lectura de 400 pares de bases . [13] Estas cifras aún no se han verificado de forma independiente fuera de la empresa.
Los principales beneficios de la secuenciación de semiconductores iónicos son la rápida velocidad de secuenciación y los bajos costos iniciales y operativos. [8] [11] Esto ha sido posible gracias a la evitación de nucleótidos modificados y mediciones ópticas.
Debido a que el sistema registra los eventos de incorporación de nucleótidos mediados por la polimerasa natural, la secuenciación puede ocurrir en tiempo real. En realidad, la tasa de secuenciación está limitada por el ciclo de los nucleótidos del sustrato a través del sistema. [14] Ion Torrent Systems Inc., el desarrollador de la tecnología, afirma que cada medición de incorporación toma 4 segundos y cada ejecución toma aproximadamente una hora, durante la cual se secuencian entre 100 y 200 nucleótidos. [11] [15] Si se mejoran los chips semiconductores (como predice la ley de Moore ), el número de lecturas por chip (y, por lo tanto, por ejecución) debería aumentar. [11]
El costo de adquirir un secuenciador mediado por pH en el momento del lanzamiento era de alrededor de 50.000 dólares estadounidenses, sin incluir el equipo de preparación de muestras ni un servidor para el análisis de datos. [8] [11] [15] El costo por ejecución también es significativamente menor que el de los métodos alternativos de secuenciación automatizada, aproximadamente 1.000 dólares. [8] [12]
Si se repiten homopolímeros del mismo nucleótido (por ejemplo,ttttt) están presentes en la cadena molde (cadena a secuenciar), luego se incorporan múltiples nucleótidos introducidos y se liberan más iones de hidrógeno en un solo ciclo. Esto da como resultado un mayor cambio de pH y una señal electrónica proporcionalmente mayor. [11] Esta es una limitación del sistema, ya que es difícil enumerar repeticiones largas. Esta limitación es compartida por otras técnicas que detectan adiciones de un solo nucleótido, como la pirosecuenciación . [16] Las señales generadas a partir de un alto número de repeticiones son difíciles de diferenciar de repeticiones de un número similar pero diferente; por ejemplo , las homorrepeticiones de longitud 7 son difíciles de diferenciar de las de longitud 8.
Otra limitación de este sistema es la corta longitud de lectura en comparación con otros métodos de secuenciación, como la secuenciación de Sanger o la pirosecuenciación. Las longitudes de lectura más largas son beneficiosas para el ensamblaje de genomas de novo . Los secuenciadores semiconductores de Ion Torrent producen una longitud de lectura promedio de aproximadamente 400 nucleótidos por lectura. [3] [8]
El rendimiento actualmente es menor que el de otras tecnologías de secuenciación de alto rendimiento, aunque los desarrolladores esperan cambiar esto aumentando la densidad del chip . [3]
Los desarrolladores del sistema de secuenciación de semiconductores Ion Torrent lo han comercializado como un secuenciador rápido, compacto y económico que puede utilizarse en un gran número de laboratorios como máquina de sobremesa. [3] [4] La empresa espera que su sistema lleve la secuenciación fuera de los centros especializados y al alcance de hospitales y laboratorios más pequeños. [17] Un artículo del New York Times de enero de 2011, "Llevar la secuenciación de ADN a las masas", subraya estas ambiciones. [17]
Debido a la capacidad de los métodos de secuenciación alternativos para lograr una mayor longitud de lectura (y, por lo tanto, ser más adecuados para el análisis del genoma completo ), esta tecnología puede ser más adecuada para aplicaciones a pequeña escala, como la secuenciación del genoma microbiano , la secuenciación del transcriptoma microbiano , la secuenciación dirigida, la secuenciación de amplicones o para pruebas de calidad de bibliotecas de secuenciación. [3] [8] [18]