La purificación por afinidad en tándem ( TAP ) es una técnica de purificación basada en inmunoprecipitación para estudiar las interacciones proteína-proteína . El objetivo es extraer de una célula sólo la proteína de interés, en complejo con cualquier otra proteína con la que haya interactuado. TAP utiliza dos tipos de perlas de agarosa que se unen a la proteína de interés y que pueden separarse del lisado celular mediante centrifugación, sin alterar, desnaturalizar ni contaminar los complejos involucrados. Para permitir que la proteína de interés se una a las perlas, se etiqueta con una pieza diseñada, la etiqueta TAP.
El método TAP original implica la fusión de la etiqueta TAP con el extremo C de la proteína en estudio. La etiqueta TAP consta de tres componentes: un péptido de unión a calmodulina (CBP), un sitio de escisión de la proteasa TEV y dos dominios de proteína A , que se unen firmemente a la IgG (lo que convierte a la etiqueta TAP en un tipo de etiqueta de epítopo ). [1]
Se han propuesto muchas otras combinaciones de etiquetas/perlas/eluyentes desde que se publicó por primera vez el principio TAP.
Esta etiqueta también se conoce como etiqueta TAP de terminal C porque también está disponible una versión de terminal N. Sin embargo, el método que se describirá supone el uso de una etiqueta C-terminal, aunque el principio detrás del método sigue siendo el mismo.
El etiquetado TAP fue inventado por un equipo de investigación que trabajaba en el Laboratorio Europeo de Biología Molecular a finales de la década de 1990 (Rigaut et al., 1999, [2] Puig et al., 2001 [3] ) y se propuso como una nueva herramienta para la exploración de proteomas. Fue utilizado por el equipo para caracterizar varios complejos proteicos (Rigaut et al., 1999, [2] Caspary et al. 1999, [4] Bouveret et al., 2000, [5] Puig et al., 2001 [3] ). La primera aplicación a gran escala de esta técnica se produjo en 2002, cuando el equipo de investigación trabajó en colaboración con científicos de la empresa de proteómica Cellzome para desarrollar un mapa visual de la interacción de más de 230 complejos multiproteicos en una célula de levadura analizando sistemáticamente etiquetando la etiqueta TAP a cada proteína. El primer informe exitoso sobre el uso de la tecnología de etiquetas TAP en plantas se produjo en 2004 (Rohila et al., 2004, [6] ).
Existen algunos métodos en los que se puede introducir la proteína de fusión en las células huésped. Si el huésped es una levadura , entonces uno de los métodos puede ser el uso de plásmidos que eventualmente traducirán la proteína de fusión dentro del huésped. Cualquiera que sea el método que se utilice, es preferible mantener la expresión de la proteína de fusión lo más cerca posible de su nivel natural. Una vez que la proteína de fusión se traduce dentro del huésped, interactuará con otras proteínas, idealmente de una manera que no se vea afectada por la etiqueta TAP.
Posteriormente, la proteína marcada (con sus compañeros de unión) se recupera mediante un proceso de selección por afinidad .
El primer tipo de cuenta agregada está recubierta con inmunoglobulina G , que se une al extremo más externo de la etiqueta TAP. Las perlas, con las proteínas de interés, se separan del lisado mediante centrifugación. Luego, las proteínas se liberan de las perlas mediante una enzima ( proteasa TEV ) que rompe la etiqueta en el sitio de escisión de TEV en el medio.
Después de este primer paso de purificación, se añade un segundo tipo de perla (recubierta con calmodulina ) a las proteínas liberadas que se une de forma reversible al resto de la etiqueta TAP que aún está en las proteínas. Las perlas se separan nuevamente mediante centrifugación, eliminando aún más los contaminantes y la proteasa TEV. [3] Finalmente, EGTA libera las perlas , dejando atrás el eluido nativo que contiene solo la proteína de interés, sus proteínas asociadas unidas y el trozo de CBP restante de la etiqueta TAP.
Luego, el eluato nativo se puede analizar mediante electroforesis en gel y espectrometría de masas para identificar las parejas de unión de la proteína.
Una ventaja de este método es que puede haber una determinación real cuantitativa de las proteínas asociadas in vivo sin conocimiento previo de la composición compleja. También es sencillo de ejecutar y, a menudo, proporciona un alto rendimiento. [3] Uno de los obstáculos al estudiar la interacción proteína-proteína es la contaminación de la proteína objetivo, especialmente cuando no tenemos ningún conocimiento previo sobre ella. TAP ofrece un medio eficaz y altamente específico para purificar la proteína objetivo. Después de 2 purificaciones por afinidad sucesivas, la posibilidad de que se retengan contaminantes en el eluato se reduce significativamente.
Sin embargo, también existe la posibilidad de que una etiqueta agregada a una proteína oculte la unión de la nueva proteína a sus parejas que interactúan. Además, la etiqueta también puede afectar los niveles de expresión de proteínas. Por otro lado, es posible que la etiqueta tampoco esté suficientemente expuesta a las perlas de afinidad, lo que distorsiona los resultados.
También puede existir la posibilidad de una escisión de las proteínas por parte de la proteasa TEV , aunque es poco probable que esto sea frecuente dada la alta especificidad de la proteasa TEV. [7]
Como este método implica al menos 2 rondas de lavado, puede no ser adecuado para detectar interacciones transitorias de proteínas, a diferencia del método de dos híbridos de levadura o la reticulación in vivo con análogos de aminoácidos fotorreactivos . Sin embargo, es un buen método para probar interacciones estables de proteínas y permite varios grados de investigación al controlar el número de veces que se purifica el complejo proteico. [ cita necesaria ]
En 2002, la etiqueta TAP se utilizó por primera vez con espectrometría de masas en un enfoque a gran escala para analizar sistemáticamente la proteómica de la levadura mediante la caracterización de complejos multiproteicos. [8] El estudio reveló 491 complejos, 257 de ellos completamente nuevos. El resto eran familiares por otras investigaciones, pero ahora se descubrió que prácticamente todos tenían componentes nuevos. Elaboraron un mapa que relaciona funcionalmente todos los componentes proteicos en una red compleja.
Muchos otros análisis proteómicos también implican el uso de etiquetas TAP. Una investigación de EMBO (Dziembowski, 2004) identificó un nuevo complejo necesario para la retención y el empalme del pre-ARNm nuclear. Han purificado un nuevo complejo trimérico compuesto por otras tres subunidades (Snu17p, Bud13p y Pml1p) y descubren que estas subunidades no son esenciales para la viabilidad, pero sí necesarias para el corte y empalme (eliminación de intrones) eficiente del pre-ARNm. En 2006, Fleischer et al. Proteínas identificadas sistemáticamente asociadas con complejos ribosomales eucariotas. [9] Utilizaron pantallas proteómicas de espectrometría de masas multifacéticas para identificar complejos ribosomales de levadura y luego utilizaron el etiquetado TAP para unir funcionalmente todas estas proteínas.
El principio de purificación por afinidad en tándem de complejos multiproteicos no se limita a la combinación de etiquetas CBP y Proteína A utilizadas en el trabajo original de Rigaut et al. (1999). Por ejemplo, la combinación de etiquetas FLAG y HA ha sido utilizada desde el año 2000 por el grupo de Nakatani [10] [11] para purificar numerosos complejos proteicos de células de mamíferos. Se han propuesto muchas otras combinaciones de etiquetas desde que se publicó el principio TAP.
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