El perfilado de polisomas es una técnica de biología molecular que se utiliza para estudiar la asociación de los ARNm con los ribosomas . Es importante señalar que esta técnica es diferente del perfilado de ribosomas . Ambas técnicas han sido revisadas [1] y ambas se utilizan en el análisis del translatoma , pero los datos que generan tienen niveles de especificidad muy diferentes. Cuando la emplean expertos, la técnica es notablemente reproducible: los 3 perfiles de la primera imagen son de 3 experimentos diferentes. [2]
El procedimiento comienza con la preparación de un lisado celular de las células de interés. Este lisado contiene polisomas , monosomas (compuestos por un ribosoma que reside en un ARNm ), las subunidades ribosómicas pequeñas (40 S en eucariotas ) y grandes (60 S en eucariotas), ARNm "libre" y una serie de otros componentes celulares solubles .
El procedimiento continúa realizando un gradiente continuo de sacarosa de densidad continuamente variable en un tubo de centrífuga . En las concentraciones utilizadas (15-45% en el ejemplo), la sacarosa no altera la asociación de los ribosomas y el ARNm. La porción del 15% del gradiente se encuentra en la parte superior del tubo, mientras que la porción del 45% se encuentra en la parte inferior debido a su diferente densidad .
Luego, se coloca una cantidad específica (medida por densidad óptica ) del lisado en capas sobre el gradiente en el tubo. El lisado, aunque contiene una gran cantidad de material soluble, es mucho menos denso que la sacarosa al 15 %, por lo que se puede mantener como una capa separada en la parte superior del tubo si esto se hace con cuidado.
Para separar los componentes del lisado, la preparación se somete a centrifugación. Esto acelera los componentes del lisado con muchas veces la fuerza de la gravedad y, por lo tanto, los impulsa a través del gradiente en función de lo "grandes" que sean los componentes individuales. Las subunidades pequeñas (40S) viajan menos lejos en el gradiente que las subunidades grandes (60S). Los ribosomas 80S en un ARNm viajan más lejos (tenga en cuenta que la contribución del tamaño del ARNm a la distancia recorrida no es significativa). Los polisomas compuestos por 2 ribosomas viajan más lejos, los polisomas con 3 ribosomas viajan aún más lejos, y así sucesivamente. El "tamaño" de los componentes se designa con S, la unidad de Svedberg . Tenga en cuenta que una S = 10 −13 segundos, y que el concepto de "grande" es en realidad una simplificación excesiva.
Después de la centrifugación, el contenido del tubo se recoge en fracciones desde la parte superior (más pequeña, de desplazamiento más lento) hasta la parte inferior (más grande, de desplazamiento más rápido) y se determina la densidad óptica de las fracciones. Las primeras fracciones extraídas tienen una gran cantidad de moléculas relativamente pequeñas, como ARNt, proteínas individuales, etc.
Es posible utilizar esta técnica para estudiar el grado general de traducción en las células (por ejemplo [3] [4] [5] ), pero se puede utilizar de forma mucho más específica para estudiar proteínas individuales y sus ARNm. Como ejemplo que se muestra en la parte inferior de la figura, una proteína que compone parte de la subunidad pequeña se puede detectar primero en la fracción 40S, luego casi desaparece de la fracción 60S (las separaciones en estos gradientes no son absolutas) y luego reaparece en las fracciones 80S y polisoma. Esto indica que hay como máximo muy poca proteína encontrada en la célula que no sea parte de la subunidad pequeña. Por el contrario, en la fila superior de la figura de inmunotransferencia, aparece una proteína soluble en las fracciones solubles y asociada a los ribosomas y polisomas. La proteína en particular es una proteína chaperona , que (en resumen) ayuda a plegar el péptido naciente a medida que se extruye del ribosoma. Como muestran otros trabajos
En el trabajo se muestra que existe una asociación directa de la chaperona con el ribosoma. [2]
La técnica también se puede utilizar para estudiar el grado de traducción de un ARNm en particular [6]. En estos experimentos, se investigaron las secuencias 5' y 3' de un ARNm para determinar sus efectos sobre la cantidad de ARNm producido y la calidad de su traducción. Como se muestra, no todas las isoformas de ARNm se traducen con la misma eficiencia, aunque sus secuencias codificantes sean las mismas. [6]