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Hidroxilasas dependientes de alfa-cetoglutarato

Las hidroxilasas dependientes de alfa-cetoglutarato son una clase importante de proteínas de hierro no hemo que catalizan una amplia gama de reacciones. Estas reacciones incluyen reacciones de hidroxilación, desmetilaciones, expansiones de anillo, cierres de anillo y desaturaciones. [1] [2] Funcionalmente, las hidroxilasas dependientes de αKG son comparables a las enzimas del citocromo P450 . Ambas utilizan O2 y equivalentes reductores como cosustratos y ambas generan agua. [3]

Función biológica

Las hidroxilasas dependientes de αKG tienen diversas funciones. [4] [5] En microorganismos como las bacterias, las dioxigenasas dependientes de αKG están involucradas en muchas vías biosintéticas y metabólicas; [6] [7] [8] por ejemplo, en E. coli , la enzima AlkB está asociada con la reparación del ADN dañado . [9] [10] En las plantas, las dioxigenasas dependientes de αKG están involucradas en diversas reacciones en el metabolismo de las plantas. [11] Estas incluyen la biosíntesis de flavonoides, [12] y la biosíntesis de etileno. [13] En mamíferos y humanos, la dioxigenasa dependiente de αKG tiene funciones en las biosíntesis (por ejemplo, biosíntesis de colágeno [14] y biosíntesis de L-carnitina [15] ), modificaciones postraduccionales (por ejemplo, hidroxilación de proteínas [16] ), regulaciones epigenéticas (por ejemplo, desmetilación de histonas y ADN [17] ), así como sensores del metabolismo energético . [18]

Muchas dioxigenasas dependientes de αKG también catalizan el recambio desacoplado, en el que la descarboxilación oxidativa de αKG en succinato y dióxido de carbono se produce en ausencia de sustrato. La actividad catalítica de muchas dioxigenasas dependientes de αKG depende de agentes reductores (especialmente ascorbato), aunque no se conocen sus funciones exactas. [19] [20]

Mecanismo catalítico

Las dioxigenasas dependientes de αKG catalizan las reacciones de oxidación incorporando un solo átomo de oxígeno del oxígeno molecular (O 2 ) a sus sustratos. Esta conversión está acoplada con la oxidación del cosustrato αKG en succinato y dióxido de carbono. [1] [2] Con O 2 marcado como sustrato, una etiqueta aparece en el succinato y otra en el sustrato hidroxilado: [21] [22]

R 3 CH + O 2 + − O 2 CC(O)CH 2 CH 2 CO 2 − → R 3 C O H + CO 2 + − O O CCH 2 CH 2 CO 2 −

El primer paso implica la unión de αKG y el sustrato al sitio activo. αKG se coordina como un ligando bidentado a Fe(II), mientras que el sustrato se mantiene mediante fuerzas no covalentes en estrecha proximidad. Posteriormente, el oxígeno molecular se une de extremo a extremo a Fe cis a los dos donantes de αKG. El extremo no coordinado del ligando superóxido ataca al carbono ceto, lo que induce la liberación de CO 2 y forma un intermedio Fe(IV)-oxo . Este centro Fe=O luego oxigena el sustrato mediante un mecanismo de rebote de oxígeno . [1] [2]

Los mecanismos alternativos no han logrado obtener apoyo. [23]

Mecanismo catalítico de consenso de la superfamilia de dioxigenasas dependientes de αKG.

Estructura

Proteína

Todas las dioxigenasas dependientes de αKG contienen un pliegue de hélice β bicatenaria conservado (DSBH, también conocido como cupina), que se forma con dos láminas β. [24] [25]

Cofactor metalúrgico

El sitio activo contiene un motivo de tríada de residuos de aminoácidos 2-His-1-carboxilato (HXD/E...H) altamente conservado, en el que el Fe(II) catalíticamente esencial está retenido por dos residuos de histidina y un residuo de ácido aspártico/ácido glutámico. La tríada N 2 O se une a una cara del centro de Fe, dejando tres sitios lábiles disponibles en el octaedro para la unión de αKG y O 2 . [1] [2] Un motivo de unión de Fe facial similar, pero que presenta una disposición his-his-his, se encuentra en la cisteína dioxigenasa .

Unión de sustrato y cosustrato

La unión de αKG y el sustrato se ha analizado mediante cristalografía de rayos X, cálculos de dinámica molecular y espectroscopia de RMN. La unión del cetoglutarato se ha observado utilizando inhibidores enzimáticos. [26]

Algunas dioxigenasas dependientes de αKG se unen a su sustrato a través de un mecanismo de ajuste inducido. Por ejemplo, se han observado cambios estructurales significativos en las proteínas tras la unión del sustrato en el caso de la isoforma 2 de la prolil hidroxilasa humana (PHD2), [27] [28] [29] una dioxigenasa dependiente de αKG que participa en la detección de oxígeno, [30] y la isopenicilina N sintasa (IPNS), una dioxigenasa microbiana dependiente de αKG. [31]

Vista simplificada del sitio activo de la isoforma 2 de la prolil hidroxilasa (PHD2), una dioxigenasa dependiente de αKG humana. El Fe(II) está coordinado por dos imidazoles y un carboxilato proporcionados por la proteína. Se omiten otros ligandos del hierro, que están ocupados transitoriamente por αKG y O 2 , para mayor claridad.

Inhibidores

Dadas las importantes funciones biológicas que desempeña la dioxigenasa dependiente de αKG, se desarrollaron muchos inhibidores de la dioxigenasa dependiente de αKG. Los inhibidores que se usaron regularmente para atacar a la dioxigenasa dependiente de αKG incluyen N-oxalilglicina (NOG), ácido piridina-2,4-dicarboxílico (2,4-PDCA), 5-carboxi-8-hidroxiquinolina, FG-2216 y FG-4592, que fueron diseñados para imitar al cosustrato αKG y competir contra la unión de αKG en el sitio activo de la enzima Fe(II). [32] [33] Aunque son potentes inhibidores de la dioxigenasa dependiente de αKG, carecen de selectividad y, por lo tanto, a veces se los denomina inhibidores de "amplio espectro". [34] También se desarrollaron inhibidores que compiten contra el sustrato, como los inhibidores basados ​​en peptidilos que se dirigen al dominio 2 de la prolil hidroxilasa humana (PHD2) [35] y Mildronate , una molécula de fármaco que se utiliza comúnmente en Rusia y Europa del Este que se dirige a la gamma-butirobetaína dioxigenasa . [36] [37] [38] Finalmente, como las dioxigenasas dependientes de αKG requieren oxígeno molecular como cosustrato, también se ha demostrado que las moléculas gaseosas como el monóxido de carbono [39] y el óxido nítrico [40] [41] son ​​inhibidores de las dioxigenasas dependientes de αKG, presumiblemente al competir con el oxígeno molecular por la unión en el sitio activo del ion Fe(II).

Inhibidores comunes de las dioxigenasas dependientes de αKG. Compiten con el cosustrato αKG por la unión al sitio activo Fe(II).

Ensayos

Se desarrollaron muchos ensayos para estudiar las dioxigenasas dependientes de αKG de modo que se pueda obtener información como la cinética enzimática, la inhibición enzimática y la unión de ligandos. La espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN) se aplica ampliamente para estudiar las dioxigenasas dependientes de αKG. [42] Por ejemplo, se desarrollaron ensayos para estudiar la unión de ligandos, [43] [44] [45] la cinética enzimática, [46] los modos de inhibición [47] así como el cambio conformacional de las proteínas. [48] La espectrometría de masas también se aplica ampliamente. Se puede utilizar para caracterizar la cinética enzimática, [49] para guiar el desarrollo de inhibidores enzimáticos, [50] estudiar la unión de ligandos y metales [51] así como analizar el cambio conformacional de las proteínas. [52] También se utilizaron ensayos que utilizan espectrofotometría, [53] por ejemplo los que miden la oxidación de 2OG, [54] la formación de succinato como coproducto [55] o la formación de productos. [56] También se aplicaron otras técnicas biofísicas que incluyen (pero no se limitan a) calorimetría de titulación isotérmica (ITC) [57] y resonancia paramagnética electrónica (EPR). [58] También se desarrollaron y utilizaron ensayos radiactivos que utilizan sustratos marcados con 14 C. [59] Dado que las dioxigenasas dependientes de αKG requieren oxígeno para su actividad catalítica, también se aplicó el ensayo de consumo de oxígeno. [60]

Lectura adicional

Referencias

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