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Dihidrofolato reductasa

La dihidrofolato reductasa , o DHFR , es una enzima que reduce el ácido dihidrofólico a ácido tetrahidrofólico , utilizando NADPH como donante de electrones , que puede convertirse en los tipos de cofactores de tetrahidrofolato utilizados en la química de transferencia de 1 carbono. En los seres humanos, la enzima DHFR está codificada por el gen DHFR . [5] [6] Se encuentra en la región q14.1 del cromosoma 5. [7]

Hay dos clases estructurales de DHFR, evolutivamente no relacionadas entre sí. El primero suele denominarse simplemente DHFR y se encuentra en los cromosomas de bacterias y animales. En las bacterias, sin embargo, la presión de los antibióticos ha provocado que esta clase evolucione con diferentes patrones de unión de moléculas diaminoheterocíclicas, lo que ha dado lugar a muchos "tipos" nombrados bajo esta clase, mientras que los de los mamíferos siguen siendo muy similares. [8] Este último (tipo II), representado por el plastidio R67 codificado, es una pequeña enzima que funciona formando un homotetrámero. [9]

Función

La dihidrofolato reductasa convierte el dihidrofolato en tetrahidrofolato , una lanzadera de protones necesaria para la síntesis de novo de purinas , ácido timidílico y ciertos aminoácidos . Si bien el gen funcional de la dihidrofolato reductasa se ha mapeado en el cromosoma 5, se han identificado múltiples pseudogenes procesados ​​sin intrones o genes similares a la dihidrofolato reductasa en cromosomas separados. [10]

El DHFR, que se encuentra en todos los organismos, tiene un papel fundamental en la regulación de la cantidad de tetrahidrofolato en la célula. El tetrahidrofolato y sus derivados son esenciales para la síntesis de purinas y timidilatos , que son importantes para la proliferación y el crecimiento celular. [11] La DHFR desempeña un papel central en la síntesis de precursores de ácidos nucleicos y se ha demostrado que las células mutantes que carecen por completo de DHFR requieren glicina, una purina y timidina para crecer. [12] También se ha demostrado que la DHFR es una enzima involucrada en la recuperación de tetrahidrobiopterina a partir de dihidrobiopterina [13]


Estructura

Una hoja central beta-plisada de ocho hebras constituye la característica principal del plegamiento de la columna vertebral polipeptídica de DHFR. [14] Siete de estas hebras son paralelas y la octava corre antiparalela. Cuatro hélices alfa conectan cadenas beta sucesivas. [15] Los residuos 9 a 24 se denominan "Met20" o "bucle 1" y, junto con otros bucles, forman parte del subdominio principal que rodea el sitio activo . [16] El sitio activo está situado en la mitad N-terminal de la secuencia, que incluye un dipéptido Pro - Trp conservado ; Se ha demostrado que el triptófano participa en la unión del sustrato por parte de la enzima. [15]

Mecanismo

Mecanismo general

La reducción de dihidrofolato a tetrahidrofolato catalizada por DHFR.

DHFR cataliza la transferencia de un hidruro de NADPH a dihidrofolato con una protonación acompañante para producir tetrahidrofolato . [11] Al final, el dihidrofolato se reduce a tetrahidrofolato y el NADPH se oxida a NADP+ . La alta flexibilidad de Met20 y otros bucles cerca del sitio activo desempeñan un papel en la promoción de la liberación del producto, tetrahidrofolato. En particular, el bucle Met20 ayuda a estabilizar el anillo de nicotinamida del NADPH para promover la transferencia del hidruro del NADPH al dihidrofolato. [dieciséis]

El mecanismo de esta enzima es gradual y aleatorio en estado estacionario. Específicamente, la reacción catalítica comienza con la unión del NADPH y el sustrato al sitio de unión de la enzima, seguida de la protonación y la transferencia de hidruro del cofactor NADPH al sustrato. Sin embargo, dos últimos pasos no tienen lugar simultáneamente en un mismo estado de transición. [17] [18] En un estudio que utiliza enfoques computacionales y experimentales, Liu et al concluyen que el paso de protonación precede a la transferencia de hidruro. [19]

DHFR (bucle Met20 resaltado) + NADPH + folato

Se ha demostrado que el mecanismo enzimático de DHFR depende del pH, particularmente el paso de transferencia de hidruro, ya que se ha demostrado que los cambios de pH tienen una influencia notable en la electrostática del sitio activo y el estado de ionización de sus residuos. [19] La acidez del nitrógeno objetivo en el sustrato es importante en la unión del sustrato al sitio de unión de la enzima, que ha demostrado ser hidrofóbico a pesar de que tiene contacto directo con el agua. [17] [20] Asp27 es el único residuo hidrófilo cargado en el sitio de unión, y la neutralización de la carga en Asp27 puede alterar el pKa de la enzima. Asp27 juega un papel crítico en el mecanismo catalítico al ayudar con la protonación del sustrato y restringir el sustrato en la conformación favorable para la transferencia de hidruro. [21] [17] [20] Se ha demostrado que el paso de protonación está asociado con la tautomerización de enol, aunque esta conversión no se considera favorable para la donación de protones. [18] Se ha demostrado que una molécula de agua participa en el paso de protonación. [22] [23] [24] La entrada de la molécula de agua al sitio activo de la enzima es facilitada por el bucle Met20. [25]

Cambios conformacionales de DHFR

La estructura cerrada se representa en rojo y la estructura ocluida se representa en verde en el esquema catalítico. En la estructura, el DHF y el THF están coloreados en rojo, el NADPH está coloreado en amarillo y el residuo de Met20 está coloreado en azul.

El ciclo catalítico de la reacción catalizada por DHFR incorpora cinco intermediarios importantes: holoenzima (E:NADPH), complejo de Michaelis (E:NADPH:DHF), complejo de producto ternario (E:NADP + :THF), complejo binario de tetrahidrofolato (E:THF ), y complejo THF‚NADPH (E:NADPH:THF). El paso de disociación del producto (THF) de E:NADPH:THF a E:NADPH es el paso determinante de la velocidad durante el recambio en estado estacionario. [21]

Los cambios conformacionales son críticos en el mecanismo catalítico de DHFR. [26] El bucle Met20 de DHFR puede abrir, cerrar u ocluir el sitio activo. [23] [17] En consecuencia, se asignan a Met20 tres conformaciones diferentes clasificadas como estados abierto, cerrado y ocluido. Además, se identificó una conformación más distorsionada de Met20 debido a sus efectos de caracterización confusos. [23] El bucle Met20 se observa en su conformación ocluida en los tres productos intermedios de ligadura, donde el anillo de nicotinamida está ocluido del sitio activo. Esta característica conformacional explica el hecho de que la sustitución de NADP + por NADPH es anterior a la disociación del producto. Por lo tanto, la siguiente ronda de reacción puede ocurrir tras la unión del sustrato. [21]

R67 DHFR

Debido a su estructura única y características catalíticas, el R67 DHFR se estudia ampliamente. R67 DHFR es un DHFR codificado por plásmido R de tipo II sin relación genética o estructural con el DHFR cromosómico de E. coli. Es un homotetrámero que posee la simetría 222 con un solo poro de sitio activo que está expuesto al solvente. [27] Esta simetría del sitio activo da como resultado un modo de unión diferente de la enzima: puede unirse con dos moléculas de dihidrofolato (DHF) con cooperatividad positiva o dos moléculas de NADPH con cooperatividad negativa, o un sustrato más uno, pero solo el último. tiene la actividad catalítica. [28] En comparación con la DHFR cromosómica de E. coli, tiene una Km más alta en la unión de dihidrofolato (DHF) y NADPH. La cinética catalítica mucho más baja muestra que la transferencia de hidruro es el paso que determina la velocidad en lugar de la liberación del producto (THF). [29]

En la estructura R67 DHFR, el homotetrámero forma un poro de sitio activo. En el proceso catalítico, DHF y NADPH ingresan al poro desde posiciones opuestas. La interacción de apilamiento π-π entre el anillo de nicotinamida de NADPH y el anillo de pteridina de DHF conecta estrechamente dos reactivos en el sitio activo. Sin embargo, se observó la flexibilidad de la cola de p-aminobenzoilglutamato de DHF tras la unión, lo que puede promover la formación del estado de transición. [30]

Significación clínica

Las mutaciones de DHFR causan deficiencia de dihidrofolato reductasa , un raro error congénito autosómico recesivo del metabolismo del folato que produce anemia megaloblástica , pancitopenia y deficiencia cerebral grave de folato . Estos problemas se pueden superar mediante la suplementación con una forma reducida de folato, generalmente ácido folínico . [10] [31] [32]

Aplicaciones terapéuticas

DHFR es un objetivo farmacéutico atractivo para la inhibición debido a su papel fundamental en la síntesis de precursores de ADN ( timina ). La trimetoprima , un antibiótico , inhibe la DHFR bacteriana, mientras que el metotrexato , un agente de quimioterapia , inhibe la DHFR de los mamíferos. Sin embargo, se ha desarrollado resistencia contra algunos fármacos, como resultado de cambios mutacionales en el propio DHFR. [33]

Cáncer

La DHFR es responsable de los niveles de tetrahidrofolato en una célula y la inhibición de la DHFR puede limitar el crecimiento y la proliferación de células características del cáncer y las infecciones bacterianas. El metotrexato , un inhibidor competitivo de la DHFR, es uno de esos fármacos anticancerígenos que inhibe la DHFR. [34]

El folato es necesario para el crecimiento [35] y la vía del metabolismo del folato es un objetivo en el desarrollo de tratamientos para el cáncer. DHFR es uno de esos objetivos. Se demostró que un régimen de fluorouracilo , doxorrubicina y metotrexato prolonga la supervivencia en pacientes con cáncer gástrico avanzado. [36] Estudios adicionales sobre los inhibidores de DHFR pueden conducir a más formas de tratar el cáncer.

Infección

Las bacterias también necesitan DHFR para crecer y multiplicarse y, por tanto, los inhibidores selectivos de DHFR bacteriano han encontrado aplicación como agentes antibacterianos. [37] Se ha demostrado que la trimetoprima tiene actividad contra una variedad de patógenos bacterianos grampositivos . [37] Sin embargo, la resistencia al trimetoprima y otros fármacos dirigidos a la DHFR puede surgir debido a una variedad de mecanismos, lo que limita el éxito de sus usos terapéuticos. [38] [39] [40] La resistencia puede surgir de la amplificación del gen DHFR, mutaciones en DHFR, [41] [42] disminución en la absorción de los fármacos, entre otros. De todos modos, la combinación de trimetoprima y sulfametoxazol se ha utilizado como agente antibacteriano durante décadas. [37]

La pirimetamina es un agente antiprotozoario ampliamente utilizado . [43]

Otras clases de compuestos que se dirigen a la DHFR en general, y a las DHFR bacterianas en particular, pertenecen a clases tales como diaminopteridinas, diaminotriazinas, diaminopirroloquinazolinas, estilbenos, chalconas, desoxibenzoínas, diaminoquinazolinas, diaminopirroloquinazolinas, por nombrar sólo algunos.

Posible tratamiento contra el ántrax

Alineación estructural de la dihidrofolato reductasa cromosómica (Tipo I) de Bacillus anthracis (BaDHFR), Staphylococcus aureus (SaDHFR), Escherichia coli (EcDHFR) y Streptococcus pneumoniae (SpDHFR).

La dihidrofolato reductasa de Bacillus anthracis (BaDHFR) es un fármaco validado para el tratamiento de la enfermedad infecciosa del ántrax. BaDHFR es menos sensible a los análogos de trimetoprima que la dihidrofolato reductasa de otras especies como Escherichia coli , Staphylococcus aureus y Streptococcus pneumoniae . Una alineación estructural de la dihidrofolato reductasa de las cuatro especies muestra que solo BaDHFR tiene la combinación fenilalanina y tirosina en las posiciones 96 y 102, respectivamente.

La resistencia de BaDHFR a los análogos de trimetoprima se debe a estos dos residuos (F96 e Y102), que también confieren una cinética y una eficiencia catalítica mejoradas. [44] La investigación actual utiliza mutantes del sitio activo en BaDHFR para guiar la optimización de los nuevos inhibidores antifolato. [44]

Como herramienta de investigación

La DHFR se ha utilizado como herramienta para detectar interacciones proteína-proteína en un ensayo de complementación de fragmentos de proteína (PCA), utilizando un enfoque de proteína dividida. [45]

Las células CHO que carecen de DHFR son la línea celular más utilizada para la producción de proteínas recombinantes. Estas células se transfectan con un plásmido que porta el gen dhfr y el gen de la proteína recombinante en un único sistema de expresión y luego se someten a condiciones selectivas en un medio sin timidina . Sólo sobreviven las células con el gen DHFR exógeno junto con el gen de interés. La suplementación de este medio con metotrexato, un inhibidor competitivo de DHFR, puede seleccionar aún más aquellas células que expresan los niveles más altos de DHFR y, por lo tanto, seleccionar los principales productores de proteínas recombinantes. [46]

Interacciones

Se ha demostrado que la dihidrofolato reductasa interactúa con GroEL [47] y Mdm2 . [48]

Mapa de ruta interactivo

Haga clic en genes, proteínas y metabolitos a continuación para vincular a los artículos respectivos. [§ 1]

  1. ^ El mapa de ruta interactivo se puede editar en WikiPathways: "FluoropyrimidineActivity_WP1601".

Referencias

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