Los fósmidos son similares a los cósmidos , pero se basan en el plásmido bacteriano F. El vector de clonación es limitado, ya que un huésped (normalmente E. coli ) solo puede contener una molécula de fósmido. Los fósmidos pueden contener insertos de ADN de hasta 40 kb de tamaño; a menudo, la fuente del inserto es ADN genómico aleatorio. Se prepara una biblioteca de fósmidos extrayendo el ADN genómico del organismo objetivo y clonándolo en el vector de fósmido. [1] Luego, la mezcla de ligadura se empaqueta en partículas de fago y el ADN se transfecta en el huésped bacteriano. Los clones bacterianos propagan la biblioteca de fósmidos. El bajo número de copias ofrece una mayor estabilidad que los vectores con números de copias relativamente más altos, incluidos los cósmidos. Los fósmidos pueden ser útiles para construir bibliotecas estables a partir de genomas complejos . Los fósmidos tienen una alta estabilidad estructural y se ha descubierto que mantienen el ADN humano de manera eficaz incluso después de 100 generaciones de crecimiento bacteriano. [2] Los clones de fósmidos se utilizaron para ayudar a evaluar la precisión de la secuencia pública del genoma humano. [3]
El plásmido de fertilidad o plásmido F fue descubierto por Esther Lederberg y codifica información para la biosíntesis del pilus sexual para ayudar en la conjugación bacteriana. La conjugación implica el uso del pilus sexual para formar un puente entre dos células bacterianas; este puente permite que la célula F+ transfiera una copia monocatenaria del plásmido para que ambas células contengan una copia del plásmido. En el camino hacia la célula receptora, la célula receptora sintetiza la cadena de ADN correspondiente. La célula donante mantiene una copia funcional del plásmido. Más tarde se descubrió que el factor F fue el primer episoma y puede existir como un plásmido independiente, lo que lo convierte en un vector muy estable para la clonación. La conjugación ayuda en la formación de bibliotecas de clones bacterianos al garantizar que todas las células contengan el fósmido deseado. [4]
Los fósmidos son vectores de ADN que utilizan el origen de replicación y los mecanismos de partición del plásmido F para permitir la clonación de grandes fragmentos de ADN. Se puede preparar fácilmente una biblioteca que proporcione una cobertura redundante de 20 a 70 veces del genoma. [5]
El primer paso para secuenciar genomas completos es clonarlos en unidades manejables de unas 50-200 kilobases de longitud. Lo ideal es utilizar una biblioteca de fósmidos debido a su estabilidad y a la limitación de un plásmido por célula. Al limitar el número de plásmidos en las células, se reduce el potencial de recombinación, con lo que se preserva el inserto del genoma. [6]
Los fósmidos contienen varios elementos funcionales:
Los métodos de corte e inserción de ADN en vectores fósmidos se han perfeccionado. Actualmente, existen muchas empresas que pueden crear una biblioteca de fósmidos a partir de cualquier muestra de ADN en un período de tiempo muy breve y a un coste relativamente bajo. Esto ha sido fundamental para permitir a los investigadores secuenciar numerosos genomas para su estudio. Mediante una variedad de métodos, se han secuenciado completamente más de 6651 genomas de organismos, y 58 695 están en proceso. [7]
A veces es difícil distinguir con precisión los cromosomas individuales en función de la longitud cromosómica, la proporción de brazos y el patrón de bandas C. Los fósmidos se pueden utilizar como marcadores citológicos fiables para la identificación de cromosomas individuales y se pueden utilizar cariotipos cromosómicos en metafase basados en la hibridación in situ fluorescente para mostrar si las posiciones de estos fósmidos se construyeron con éxito. [8]
El sistema de fósmidos es excelente para crear rápidamente bibliotecas de mini-BAC específicas de cromosomas a partir de ADN cromosómico clasificado por flujo. La principal ventaja de los fósmidos sobre otros sistemas de cósmidos reside en su capacidad de propagar de forma estable fragmentos de ADN humano. [9] El ADN humano, de naturaleza altamente repetitiva, es bien conocido por su extrema inestabilidad en sistemas de vectores multicopia. Se ha descubierto que la estabilidad aumenta drásticamente cuando los insertos de ADN humano están presentes en copias individuales en células de E. coli deficientes en recombinación . Por lo tanto, los fósmidos sirven como sustratos fiables para la secuenciación de ADN genómico a gran escala. [2]