TILLING ( Targeting Induced Local Lesions in Genomes ) es un método de biología molecular que permite la identificación dirigida de mutaciones en un gen específico . TILLING se introdujo en 2000, utilizando la planta modelo Arabidopsis thaliana , y se amplió a otros usos y metodologías por un pequeño grupo de científicos, incluido Luca Comai . Desde entonces, TILLING se ha utilizado como método de genética inversa en otros organismos como el pez cebra , el maíz , el trigo , el arroz , la soja , el tomate y la lechuga .
El método combina una técnica estándar y eficiente de mutagénesis utilizando un mutágeno químico como el metanosulfonato de etilo (EMS) con una técnica de detección de ADN sensible que identifica mutaciones de una sola base (también llamadas mutaciones puntuales) en un gen objetivo. El método TILLING se basa en la formación de heterodúplex de ADN que se forman cuando se amplifican múltiples alelos mediante PCR y luego se calientan y enfrían lentamente. Se forma una " burbuja " en el desajuste de las dos hebras de ADN, que luego es escindida por una nucleasa monocatenaria . Luego, los productos se separan por tamaño en varias plataformas diferentes (ver a continuación).
Los desajustes pueden deberse a mutaciones inducidas, heterocigosidad dentro de un individuo o variación natural entre individuos.
EcoTILLING [1] [2] [3] [4] es un método que utiliza técnicas TILLING para buscar mutaciones naturales en individuos, generalmente para análisis genéticos de poblaciones. DEcoTILLING [5] es una modificación de TILLING y EcoTILLING que utiliza un método económico para identificar fragmentos. Desde la aparición de las tecnologías de secuenciación NGS , se ha desarrollado TILLING-by-sequencing [6] basado en la secuenciación Illumina de genes diana amplificados a partir de plantillas agrupadas multidimensionalmente para identificar posibles cambios de un solo nucleótido.
Existen varias fuentes de nucleasas monocatenarias. La primera enzima ampliamente utilizada fue la nucleasa de frijol mungo , pero se ha demostrado que esta nucleasa tiene una alta actividad no específica y solo funciona a un pH bajo, lo que puede degradar los productos de PCR y los cebadores marcados con colorante. La fuente original de la nucleasa monocatenaria era CEL1 o CJE (extracto de jugo de apio), pero otros productos han ingresado al mercado, incluidas las enzimas SNiPerase de Frontier Genomics, que se han optimizado para su uso en plataformas que utilizan productos de PCR marcados y no marcados (consulte la siguiente sección). Transgenomic aisló la proteína nucleasa monocatenaria y la vende como una forma recombinante. La ventaja de la forma recombinante es que, a diferencia de las mezclas de enzimas, no contiene actividad nucleasa no específica, que puede degradar los colorantes en los cebadores de PCR. La desventaja es un costo sustancialmente más alto.
El primer artículo que describe TILLING utilizó HPLC para identificar mutaciones (McCallum et al., 2000a). El método se hizo más eficiente mediante el uso de la enzima de restricción Cel-I combinada con el sistema basado en gel LICOR para identificar mutaciones (Colbert et al., 2001). Las ventajas de utilizar este sistema son que los sitios de mutación se pueden confirmar y diferenciar fácilmente del ruido. Esto se debe a que se pueden utilizar colorantes de diferentes colores para los cebadores directos e inversos. Una vez que los productos de escisión se han ejecutado en un gel, se pueden ver en canales separados y, al igual que un RFLP, los tamaños de los fragmentos dentro de un carril en cada canal deben sumarse al tamaño completo del producto. Las ventajas del sistema LICOR son la separación de fragmentos grandes (~ 2 kb), el alto rendimiento de las muestras (96 muestras cargadas en peines de papel) y el software gratuito para identificar las mutaciones (GelBuddy). Las desventajas del sistema LICOR son tener que verter geles en losas y los largos tiempos de ejecución (~ 4 horas). Los métodos TILLING y EcoTILLING ahora se utilizan en sistemas capilares de Advanced Analytical Technologies, ABI y Beckman.
Se pueden utilizar varios sistemas para separar los productos de PCR que no están marcados con colorantes. Los sistemas de electroforesis de agarosa simples separarán los productos de escisión de manera económica y con equipo de laboratorio estándar. Esto se utilizó para descubrir SNP en salmón chum y se denominó DEcoTILLING. La desventaja de este sistema es la resolución reducida en comparación con los sistemas de poliacrilamida. Elchrom Scientific vende geles Spreadex que están prefabricados, pueden tener un alto rendimiento y son más sensibles que los geles de poliacrilamida estándar. Advanced Analytical Technologies Inc vende el sistema fluorescente AdvanCE FS96 dsDNA, que es un sistema de electroforesis capilar de 96 que tiene varias ventajas sobre los métodos tradicionales; incluida la capacidad de separar fragmentos grandes (hasta 40 kb), no requiere un paso de desalinización o precipitación, tiempos de ejecución cortos (~30 minutos), sensibilidad a 5 pg/ul y no necesita cebadores marcados con fluorescencia.
Existen en todo el mundo varios centros de labranza que se centran en especies de importancia agrícola:
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