La espectrofotometría es una rama de la espectroscopia electromagnética que se ocupa de la medición cuantitativa de las propiedades de reflexión o transmisión de un material en función de la longitud de onda. [2] La espectrofotometría utiliza fotómetros , conocidos como espectrofotómetros, que pueden medir la intensidad de un haz de luz en diferentes longitudes de onda. Aunque la espectrofotometría se aplica más comúnmente a la radiación ultravioleta, visible e infrarroja , los espectrofotómetros modernos pueden interrogar amplias franjas del espectro electromagnético , incluidas las longitudes de onda de rayos X , ultravioleta , visible , infrarrojo y/o microondas .
La espectrofotometría es una herramienta que se basa en el análisis cuantitativo de moléculas en función de la cantidad de luz que absorben los compuestos coloreados. Las características importantes de los espectrofotómetros son el ancho de banda espectral (el rango de colores que puede transmitir a través de la muestra de prueba), el porcentaje de transmisión de la muestra, el rango logarítmico de absorción de la muestra y, a veces, un porcentaje de medición de reflectancia.
Un espectrofotómetro se utiliza comúnmente para la medición de la transmitancia o reflectancia de soluciones, sólidos transparentes u opacos, como vidrio pulido, o gases. Aunque muchos productos bioquímicos son coloreados, es decir, absorben luz visible y, por lo tanto, se pueden medir mediante procedimientos colorimétricos, incluso los productos bioquímicos incoloros a menudo se pueden convertir en compuestos coloreados adecuados para reacciones cromogénicas de formación de color para producir compuestos adecuados para el análisis colorimétrico. [3] : 65 Sin embargo, también se pueden diseñar para medir la difusividad en cualquiera de los rangos de luz enumerados que generalmente cubren alrededor de 200-2500 nm utilizando diferentes controles y calibraciones . [2] Dentro de estos rangos de luz, se necesitan calibraciones en la máquina utilizando estándares que varían en tipo dependiendo de la longitud de onda de la determinación fotométrica . [4]
Un ejemplo de un experimento en el que se utiliza la espectrofotometría es la determinación de la constante de equilibrio de una solución. Una determinada reacción química dentro de una solución puede ocurrir en dirección directa e inversa, donde los reactivos forman productos y los productos se descomponen en reactivos. En algún momento, esta reacción química alcanzará un punto de equilibrio llamado punto de equilibrio. Para determinar las concentraciones respectivas de reactivos y productos en este punto, se puede probar la transmitancia de luz de la solución mediante espectrofotometría. La cantidad de luz que pasa a través de la solución es indicativa de la concentración de ciertas sustancias químicas que no permiten el paso de la luz.
La absorción de la luz se debe a la interacción de la luz con los modos electrónicos y vibracionales de las moléculas. Cada tipo de molécula tiene un conjunto individual de niveles de energía asociados con la composición de sus enlaces químicos y núcleos y, por lo tanto, absorberá luz de longitudes de onda o energías específicas, lo que da como resultado propiedades espectrales únicas. [5] Esto se basa en su composición específica y distintiva.
El uso de espectrofotómetros abarca varios campos científicos, como la física , la ciencia de los materiales , la química , la bioquímica , la ingeniería química y la biología molecular . [6] Se utilizan ampliamente en muchas industrias, incluidas las de semiconductores, fabricación de láser y óptica, impresión y examen forense, así como en laboratorios para el estudio de sustancias químicas. La espectrofotometría se utiliza a menudo en mediciones de actividades enzimáticas, determinaciones de concentraciones de proteínas, determinaciones de constantes cinéticas enzimáticas y mediciones de reacciones de unión de ligandos. [3] : 65 En última instancia, un espectrofotómetro puede determinar, dependiendo del control o la calibración, qué sustancias están presentes en un objetivo y exactamente cuánto a través de cálculos de longitudes de onda observadas.
En astronomía , el término espectrofotometría se refiere a la medición del espectro de un objeto celeste en el que la escala de flujo del espectro se calibra en función de la longitud de onda , generalmente por comparación con una observación de una estrella estándar espectrofotométrica, y se corrige para la absorción de luz por la atmósfera de la Tierra. [7]
Inventado por Arnold O. Beckman en 1940 [ disputado – discutir ] , el espectrofotómetro fue creado con la ayuda de sus colegas de su empresa National Technical Laboratories fundada en 1935 que se convertiría en Beckman Instrument Company y finalmente Beckman Coulter . Esto vendría como una solución a los espectrofotómetros creados anteriormente que no podían absorber la luz ultravioleta correctamente. Comenzaría con la invención del Modelo A donde se utilizaba un prisma de vidrio para absorber la luz ultravioleta. Se encontraría que esto no daba resultados satisfactorios, por lo tanto, en el Modelo B, hubo un cambio de un prisma de vidrio a un prisma de cuarzo que permitió mejores resultados de absorbancia. A partir de ahí, nació el Modelo C con un ajuste a la resolución de la longitud de onda que terminó teniendo tres unidades producidas. El último y más popular modelo se convirtió en el Modelo D que es mejor reconocido ahora como el espectrofotómetro DU que contenía la caja del instrumento, la lámpara de hidrógeno con continuo ultravioleta y un mejor monocromador. [8] Se fabricó entre 1941 y 1976, y en 1941 su precio era de 723 dólares (los accesorios de luz ultravioleta lejana eran una opción con un coste adicional). En palabras del premio Nobel de Química Bruce Merrifield , fue "probablemente el instrumento más importante jamás desarrollado para el avance de la biociencia". [9]
Una vez que se discontinuó en 1976, [10] Hewlett-Packard creó el primer espectrofotómetro de matriz de diodos disponible comercialmente en 1979, conocido como HP 8450A. [11] Los espectrofotómetros de matriz de diodos se diferenciaban del espectrofotómetro original creado por Beckman porque era el primer espectrofotómetro de haz único controlado por microprocesador que escaneaba múltiples longitudes de onda a la vez en segundos. Irradia la muestra con luz policromática que la muestra absorbe dependiendo de sus propiedades. Luego se transmite de vuelta mediante la rejilla de la matriz de fotodiodos que detecta la región de longitud de onda del espectro. [12] Desde entonces, la creación e implementación de dispositivos de espectrofotometría ha aumentado enormemente y se ha convertido en uno de los instrumentos más innovadores de nuestro tiempo.
Existen dos clases principales de dispositivos: de haz único y de haz doble. Un espectrofotómetro de haz doble [13] compara la intensidad de la luz entre dos trayectorias de luz, una que contiene una muestra de referencia y la otra, la muestra de prueba. Un espectrofotómetro de haz único mide la intensidad de la luz relativa del haz antes y después de insertar una muestra de prueba. Aunque las mediciones de comparación de los instrumentos de haz doble son más fáciles y estables, los instrumentos de haz único pueden tener un rango dinámico mayor y son ópticamente más simples y compactos. Además, algunos instrumentos especializados, como los espectrofotómetros incorporados a microscopios o telescopios, son instrumentos de haz único debido a su practicidad.
Históricamente, los espectrofotómetros utilizan un monocromador que contiene una rejilla de difracción para producir el espectro analítico. La rejilla puede ser móvil o fija. Si se utiliza un solo detector, como un tubo fotomultiplicador o un fotodiodo , la rejilla se puede escanear paso a paso (espectrofotómetro de barrido) de modo que el detector pueda medir la intensidad de la luz en cada longitud de onda (que corresponderá a cada "paso"). También se pueden utilizar conjuntos de detectores (espectrofotómetro de matriz), como dispositivos acoplados a carga (CCD) o conjuntos de fotodiodos (PDA). En tales sistemas, la rejilla es fija y la intensidad de cada longitud de onda de la luz se mide mediante un detector diferente en el conjunto. Además, la mayoría de los espectrofotómetros de infrarrojo medio modernos utilizan una técnica de transformada de Fourier para adquirir la información espectral. Esta técnica se denomina espectroscopia infrarroja por transformada de Fourier .
Al realizar mediciones de transmisión, el espectrofotómetro compara cuantitativamente la fracción de luz que pasa a través de una solución de referencia y una solución de prueba, luego compara electrónicamente las intensidades de las dos señales y calcula el porcentaje de transmisión de la muestra en comparación con el estándar de referencia. Para las mediciones de reflectancia, el espectrofotómetro compara cuantitativamente la fracción de luz que se refleja desde las muestras de referencia y de prueba. La luz de la lámpara fuente pasa a través de un monocromador, que difracta la luz en un "arco iris" de longitudes de onda a través de un prisma giratorio y emite anchos de banda estrechos de este espectro difractado a través de una rendija mecánica en el lado de salida del monocromador. Estos anchos de banda se transmiten a través de la muestra de prueba. Luego, la densidad de flujo de fotones (vatios por metro cuadrado generalmente) de la luz transmitida o reflejada se mide con un fotodiodo, CCD u otro sensor de luz . Luego, el valor de transmitancia o reflectancia para cada longitud de onda de la muestra de prueba se compara con los valores de transmisión o reflectancia de la muestra de referencia. La mayoría de los instrumentos aplicarán una función logarítmica a la relación de transmitancia lineal para calcular la "absorbencia" de la muestra, un valor que es proporcional a la "concentración" de la sustancia química que se está midiendo.
En resumen, la secuencia de eventos en un espectrofotómetro de barrido es la siguiente:
En un espectrofotómetro de matriz, la secuencia es la siguiente: [14]
Muchos espectrofotómetros antiguos deben calibrarse mediante un procedimiento conocido como "puesta a cero", para equilibrar la salida de corriente nula de los dos haces en el detector. La transmisión de una sustancia de referencia se establece como un valor de referencia, de modo que la transmisión de todas las demás sustancias se registra en relación con la sustancia "puesta a cero" inicial. A continuación, el espectrofotómetro convierte la relación de transmisión en "absorbencia", la concentración de componentes específicos de la muestra de prueba en relación con la sustancia inicial. [6]
Existen algunos tipos comunes de espectrofotómetros que incluyen: Espectrofotómetro UV-vis: mide la absorción de luz en rangos UV y visible (200-800 nm). Se utiliza para la cuantificación de muchos compuestos inorgánicos y orgánicos. 1. Espectrofotómetro infrarrojo: mide la absorción de luz infrarroja, lo que permite la identificación de enlaces químicos y grupos funcionales. 2. Espectrofotómetro de absorción atómica (AAS): utiliza la absorción de luz por átomos de analito vaporizados para determinar concentraciones de metales y metaloides. 3. Espectrofotómetro de fluorescencia: mide la intensidad de la luz fluorescente emitida por las muestras después de la excitación. Permite un análisis altamente sensible de muestras con fluorescencia nativa o inducida. 4. Colorímetro: espectrofotómetros simples utilizados para medir la absorción de luz para ensayos y pruebas colorimétricas. [15]
La espectrofotometría es una técnica importante que se utiliza en muchos experimentos bioquímicos que implican el aislamiento de ADN, ARN y proteínas, la cinética enzimática y los análisis bioquímicos. [16] Dado que las muestras en estas aplicaciones no están fácilmente disponibles en grandes cantidades, son especialmente adecuadas para ser analizadas en esta técnica no destructiva. Además, se puede ahorrar una valiosa muestra utilizando una plataforma de microvolumen en la que se requiere tan solo 1 uL de muestra para análisis completos. [17] Una breve explicación del procedimiento de espectrofotometría incluye la comparación de la absorbancia de una muestra en blanco que no contiene un compuesto coloreado con una muestra que contiene un compuesto coloreado. Esta coloración se puede lograr mediante un tinte como el tinte azul brillante de Coomassie G-250 medido a 595 nm o mediante una reacción enzimática como la observada entre la β-galactosidasa y el ONPG (vuelve amarilla la muestra) medida a 420 nm. [3] : 21–119 El espectrofotómetro se utiliza para medir compuestos coloreados en la región visible de la luz (entre 350 nm y 800 nm), [3] : 65 por lo que se puede utilizar para encontrar más información sobre la sustancia que se está estudiando. En los experimentos bioquímicos, se elige una propiedad química y/o física y el procedimiento que se utiliza es específico para esa propiedad para derivar más información sobre la muestra, como la cantidad, pureza, actividad enzimática, etc. La espectrofotometría se puede utilizar para una serie de técnicas, como determinar la absorbancia de longitud de onda óptima de las muestras, determinar el pH óptimo para la absorbancia de las muestras, determinar las concentraciones de muestras desconocidas y determinar el pKa de varias muestras. [3] : 21–119 La espectrofotometría también es un proceso útil para la purificación de proteínas [18] y también se puede utilizar como un método para crear ensayos ópticos de un compuesto. Los datos espectrofotométricos también se pueden utilizar junto con la ecuación de Beer-Lambert, , para determinar varias relaciones entre la transmitancia y la concentración, y la absorbancia y la concentración. [3] : 21–119 Debido a que un espectrofotómetro mide la longitud de onda de un compuesto a través de su color, se puede agregar una sustancia que se une al colorante para que pueda experimentar un cambio de color y medirse. [19] Es posible conocer las concentraciones de una mezcla de dos componentes utilizando los espectros de absorción de las soluciones estándar de cada componente. Para hacer esto, es necesario conocer el coeficiente de extinción de esta mezcla en dos longitudes de onda y los coeficientes de extinción de soluciones que contienen los pesos conocidos de los dos componentes. [20]Además del modelo tradicional de la ley de Beer-Lamberts, se puede utilizar la espectroscopia sin etiquetas basada en cubetas, que agrega un filtro óptico en las vías de la luz, lo que permite que el espectrofotómetro cuantifique la concentración, el tamaño y el índice de refracción de las muestras siguiendo la ley de Hands. [21] Los espectrofotómetros se han desarrollado y mejorado a lo largo de décadas y se han utilizado ampliamente entre los químicos. Además, los espectrofotómetros están especializados para medir valores de absorbancia de longitud de onda de luz UV o visible. [3] : 21–119 Se considera un instrumento de alta precisión que también es muy sensible y, por lo tanto, extremadamente preciso, especialmente para determinar el cambio de color. [22] Este método también es conveniente para su uso en experimentos de laboratorio porque es un proceso económico y relativamente simple.
La mayoría de los espectrofotómetros se utilizan en las regiones ultravioleta y visible del espectro, y algunos de estos instrumentos también funcionan en la región del infrarrojo cercano . La concentración de una proteína se puede estimar midiendo la DO a 280 nm debido a la presencia de triptófano, tirosina y fenilalanina. Este método no es muy preciso ya que la composición de las proteínas varía mucho y las proteínas que no contienen ninguno de estos aminoácidos no tienen una absorción máxima a 280 nm. La contaminación con ácidos nucleicos también puede interferir. Este método requiere un espectrofotómetro capaz de medir en la región ultravioleta con cubetas de cuarzo. [3] : 135
La espectroscopia ultravioleta-visible (UV-vis) involucra niveles de energía que excitan las transiciones electrónicas. La absorción de luz UV-vis excita las moléculas que se encuentran en estados fundamentales a sus estados excitados. [5]
La espectrofotometría de la región visible de 400 a 700 nm se utiliza ampliamente en la ciencia de la colorimetría . Es un hecho conocido que funciona mejor en el rango de 0,2 a 0,8 OD. Los fabricantes de tinta, las empresas de impresión, los proveedores de textiles y muchos más necesitan los datos proporcionados a través de la colorimetría. Toman lecturas en la región de cada 5 a 20 nanómetros a lo largo de la región visible y producen una curva de reflectancia espectral o un flujo de datos para presentaciones alternativas. Estas curvas se pueden utilizar para probar un nuevo lote de colorante para verificar si coincide con las especificaciones, por ejemplo, las normas de impresión ISO.
Los espectrofotómetros de la región visible tradicionales no pueden detectar si un colorante o el material base tiene fluorescencia. Esto puede dificultar la gestión de los problemas de color si, por ejemplo, una o más de las tintas de impresión son fluorescentes. Cuando un colorante contiene fluorescencia, se utiliza un espectrofotómetro fluorescente biespectral. Hay dos configuraciones principales para los espectrofotómetros de espectro visual, d/8 (esférico) y 0/45. Los nombres se deben a la geometría de la fuente de luz, el observador y el interior de la cámara de medición. Los científicos utilizan este instrumento para medir la cantidad de compuestos en una muestra. Si el compuesto está más concentrado, la muestra absorberá más luz; dentro de rangos pequeños, se cumple la ley de Beer-Lambert y la absorbancia entre muestras varía con la concentración de forma lineal. En el caso de las mediciones de impresión, se utilizan comúnmente dos configuraciones alternativas: sin/con filtro UV para controlar mejor el efecto de los abrillantadores UV dentro del papel.
Las muestras se preparan generalmente en cubetas ; según la región de interés, pueden estar hechas de vidrio , plástico (región de interés del espectro visible) o cuarzo (región de interés del espectro ultravioleta lejano). Algunas aplicaciones requieren mediciones de volúmenes pequeños que se pueden realizar con plataformas de microvolúmenes.
Como se describe en la sección de aplicaciones, la espectrofotometría se puede utilizar tanto en el análisis cualitativo como cuantitativo de ADN, ARN y proteínas. Se puede utilizar el análisis cualitativo y los espectrofotómetros se utilizan para registrar los espectros de los compuestos escaneando regiones de longitud de onda amplias para determinar las propiedades de absorbancia (la intensidad del color) del compuesto en cada longitud de onda. [5] Un experimento que puede demostrar los diversos usos que puede tener la espectrofotometría visible es la separación de la β-galactosidasa de una mezcla de varias proteínas. En general, la espectrofotometría se utiliza mejor para ayudar a cuantificar la cantidad de purificación que ha sufrido su muestra en relación con la concentración total de proteínas. Al realizar una cromatografía de afinidad, la β-galactosidasa se puede aislar y probar haciendo reaccionar las muestras recolectadas con orto-nitrofenil-β-galactosida (ONPG) y determinando si la muestra se vuelve amarilla. [3] : 21–119 Después de esta prueba, la muestra a 420 nm para la interacción específica con ONPG y a 595 para un ensayo de Bradford, se puede evaluar cuantitativamente la cantidad de purificación. [3] : 21–119 Además de esto, la espectrofotometría se puede utilizar junto con otras técnicas como la electroforesis SDS-Page para purificar y aislar varias muestras de proteínas.
Los espectrofotómetros diseñados para la región infrarroja son bastante diferentes debido a los requisitos técnicos de medición en esa región. Un factor importante es el tipo de fotosensores disponibles para las diferentes regiones espectrales, pero la medición infrarroja también es un desafío porque prácticamente todo emite IR como radiación térmica, especialmente en longitudes de onda superiores a aproximadamente 5 μm.
Otra complicación es que muchos materiales, como el vidrio y el plástico, absorben los rayos infrarrojos, lo que los hace incompatibles como medio óptico. Los materiales ópticos ideales son las sales , que no absorben con fuerza. Las muestras para espectrofotometría IR se pueden untar entre dos discos de bromuro de potasio o moler con bromuro de potasio y prensar hasta formar una pastilla. Cuando se deben medir soluciones acuosas, se utiliza cloruro de plata insoluble para construir la celda.
Los espectrofotómetros , que funcionan de manera similar a los espectrofotómetros de la región visible, están diseñados para medir la densidad espectral de los iluminantes. Las aplicaciones pueden incluir la evaluación y categorización de la iluminación para las ventas por parte del fabricante o para que los clientes confirmen que la lámpara que decidieron comprar cumple con sus especificaciones. Componentes:
