La espectrofotometría es una rama de la espectroscopia electromagnética que se ocupa de la medición cuantitativa de las propiedades de reflexión o transmisión de un material en función de la longitud de onda. [2] La espectrofotometría utiliza fotómetros , conocidos como espectrofotómetros, que pueden medir la intensidad de un haz de luz en diferentes longitudes de onda. Aunque la espectrofotometría se aplica más comúnmente a la radiación ultravioleta, visible e infrarroja , los espectrofotómetros modernos pueden interrogar amplias franjas del espectro electromagnético , incluidas las longitudes de onda de rayos X , ultravioleta , visible , infrarroja y/o microondas .
La espectrofotometría es una herramienta que depende del análisis cuantitativo de moléculas en función de la cantidad de luz absorbida por los compuestos coloreados. Las características importantes de los espectrofotómetros son el ancho de banda espectral (el rango de colores que puede transmitir a través de la muestra de prueba), el porcentaje de transmisión de la muestra, el rango logarítmico de absorción de la muestra y, a veces, un porcentaje de medición de reflectancia.
Un espectrofotómetro se usa comúnmente para medir la transmitancia o reflectancia de soluciones, sólidos transparentes u opacos, como vidrio pulido, o gases. Aunque muchos productos bioquímicos son coloreados, es decir, absorben la luz visible y, por lo tanto, pueden medirse mediante procedimientos colorimétricos, incluso los bioquímicos incoloros a menudo pueden convertirse en compuestos coloreados adecuados para reacciones cromogénicas de formación de color para producir compuestos adecuados para el análisis colorimétrico. [3] : 65 Sin embargo, también se pueden diseñar para medir la difusividad en cualquiera de los rangos de luz enumerados que generalmente cubren alrededor de 200 a 2500 nm utilizando diferentes controles y calibraciones . [2] Dentro de estos rangos de luz, se necesitan calibraciones en la máquina utilizando estándares que varían en tipo dependiendo de la longitud de onda de la determinación fotométrica . [4]
Un ejemplo de experimento en el que se utiliza espectrofotometría es la determinación de la constante de equilibrio de una solución. Una determinada reacción química dentro de una solución puede ocurrir en dirección directa e inversa, donde los reactivos forman productos y los productos se descomponen en reactivos. En algún momento, esta reacción química alcanzará un punto de equilibrio llamado punto de equilibrio. Para determinar las concentraciones respectivas de reactivos y productos en este punto, se puede probar la transmitancia de luz de la solución mediante espectrofotometría. La cantidad de luz que pasa a través de la solución es indicativa de la concentración de ciertas sustancias químicas que no dejan pasar la luz.
La absorción de luz se debe a la interacción de la luz con los modos electrónicos y vibratorios de las moléculas. Cada tipo de molécula tiene un conjunto individual de niveles de energía asociados con la composición de sus enlaces químicos y núcleos y, por lo tanto, absorberá luz de longitudes de onda o energías específicas, lo que dará como resultado propiedades espectrales únicas. [5] Esto se basa en su composición específica y distinta.
El uso de espectrofotómetros abarca varios campos científicos, como la física , la ciencia de los materiales , la química , la bioquímica , la ingeniería química y la biología molecular . [6] Se utilizan ampliamente en muchas industrias, incluidas las de semiconductores, fabricación de láser y óptica, impresión y exámenes forenses, así como en laboratorios para el estudio de sustancias químicas. La espectrofotometría se utiliza a menudo para medir actividades enzimáticas, determinaciones de concentraciones de proteínas, determinaciones de constantes cinéticas enzimáticas y mediciones de reacciones de unión a ligandos. [3] : 65 En última instancia, un espectrofotómetro es capaz de determinar, dependiendo del control o calibración, qué sustancias están presentes en un objetivo y exactamente en qué cantidad mediante cálculos de las longitudes de onda observadas.
En astronomía , el término espectrofotometría se refiere a la medición del espectro de un objeto celeste en la que la escala de flujo del espectro se calibra en función de la longitud de onda , generalmente en comparación con una observación de una estrella estándar espectrofotométrica, y se corrige por la absorción. de luz por la atmósfera terrestre. [7]
Inventado por Arnold O. Beckman en 1940 [ disputado – discutir ] , el espectrofotómetro fue creado con la ayuda de sus colegas de su empresa National Technical Laboratories, fundada en 1935, que se convertiría en Beckman Instrument Company y, en última instancia, en Beckman Coulter . Esto vendría como una solución a los espectrofotómetros creados anteriormente que no eran capaces de absorber el ultravioleta correctamente. Comenzaría con la invención del Modelo A, en el que se utilizaba un prisma de vidrio para absorber la luz ultravioleta. Se encontró que esto no dio resultados satisfactorios, por lo tanto, en el Modelo B, hubo un cambio de un prisma de vidrio a uno de cuarzo, lo que permitió mejores resultados de absorbancia. A partir de ahí nació el Modelo C con un ajuste en la resolución de longitud de onda del que se terminaron produciendo tres unidades. El último y más popular modelo se convirtió en el Modelo D, que ahora se reconoce mejor como el espectrofotómetro DU que contenía la caja del instrumento, una lámpara de hidrógeno con espectro ultravioleta continuo y un mejor monocromador. [8] Se produjo entre 1941 y 1976, donde su precio en 1941 era de 723 dólares estadounidenses (los accesorios de radiación ultravioleta lejana eran una opción con un costo adicional). En palabras del premio Nobel de química Bruce Merrifield , fue "probablemente el instrumento más importante jamás desarrollado para el avance de la biociencia". [9]
Una vez que dejó de fabricarse en 1976, [10] Hewlett-Packard creó el primer espectrofotómetro de matriz de diodos disponible comercialmente en 1979, conocido como HP 8450A. [11] Los espectrofotómetros de matriz de diodos se diferenciaban del espectrofotómetro original creado por Beckman porque fue el primer espectrofotómetro controlado por microprocesador de haz único que escaneaba múltiples longitudes de onda a la vez en segundos. Irradia la muestra con luz policromática que la muestra absorbe en función de sus propiedades. Luego se transmite de regreso mediante la red de fotodiodos que detecta la región de longitud de onda del espectro. [12] Desde entonces, la creación e implementación de dispositivos de espectrofotometría ha aumentado enormemente y se ha convertido en uno de los instrumentos más innovadores de nuestro tiempo.
Hay dos clases principales de dispositivos: de haz único y de doble haz. Un espectrofotómetro de doble haz [13] compara la intensidad de la luz entre dos caminos de luz, uno que contiene una muestra de referencia y el otro la muestra de prueba. Un espectrofotómetro de haz único mide la intensidad luminosa relativa del haz antes y después de insertar una muestra de prueba. Aunque las mediciones comparativas con instrumentos de doble haz son más fáciles y estables, los instrumentos de haz único pueden tener un rango dinámico mayor y son ópticamente más simples y compactos. Además, algunos instrumentos especializados, como los espectrofotómetros integrados en microscopios o telescopios, son instrumentos de haz único debido a su practicidad.
Históricamente, los espectrofotómetros utilizan un monocromador que contiene una rejilla de difracción para producir el espectro analítico. La rejilla puede ser móvil o fija. Si se utiliza un solo detector, como un tubo fotomultiplicador o un fotodiodo , la rejilla se puede escanear paso a paso (espectrofotómetro de escaneo) para que el detector pueda medir la intensidad de la luz en cada longitud de onda (que corresponderá a cada "paso"). También se pueden utilizar conjuntos de detectores (espectrofotómetro de conjuntos), tales como dispositivos de carga acoplada (CCD) o conjuntos de fotodiodos (PDA). En tales sistemas, la rejilla es fija y la intensidad de cada longitud de onda de luz se mide mediante un detector diferente en la matriz. Además, la mayoría de los espectrofotómetros de infrarrojo medio modernos utilizan una técnica de transformada de Fourier para adquirir la información espectral. Esta técnica se llama espectroscopia infrarroja por transformada de Fourier .
Al realizar mediciones de transmisión, el espectrofotómetro compara cuantitativamente la fracción de luz que pasa a través de una solución de referencia y una solución de prueba, luego compara electrónicamente las intensidades de las dos señales y calcula el porcentaje de transmisión de la muestra en comparación con el estándar de referencia. Para las mediciones de reflectancia, el espectrofotómetro compara cuantitativamente la fracción de luz que se refleja en las muestras de referencia y de prueba. La luz de la lámpara fuente pasa a través de un monocromador, que difracta la luz en un "arco iris" de longitudes de onda a través de un prisma giratorio y emite anchos de banda estrechos de este espectro difractado a través de una ranura mecánica en el lado de salida del monocromador. Estos anchos de banda se transmiten a través de la muestra de prueba. Luego, la densidad de flujo de fotones (generalmente vatios por metro cuadrado) de la luz transmitida o reflejada se mide con un fotodiodo, un dispositivo de carga acoplada u otro sensor de luz . Luego se compara el valor de transmitancia o reflectancia para cada longitud de onda de la muestra de prueba con los valores de transmisión o reflectancia de la muestra de referencia. La mayoría de los instrumentos aplicarán una función logarítmica a la relación de transmitancia lineal para calcular la "absorbencia" de la muestra, un valor que es proporcional a la "concentración" de la sustancia química que se está midiendo.
En resumen, la secuencia de eventos en un espectrofotómetro de barrido es la siguiente:
En un espectrofotómetro de matriz, la secuencia es la siguiente: [14]
Muchos espectrofotómetros más antiguos deben calibrarse mediante un procedimiento conocido como "puesta a cero", para equilibrar la salida de corriente nula de los dos haces en el detector. La transmisión de una sustancia de referencia se establece como valor de referencia (dato), por lo que la transmisión de todas las demás sustancias se registra en relación con la sustancia inicial "puesta a cero". Luego, el espectrofotómetro convierte la relación de transmisión en "absorbencia", la concentración de componentes específicos de la muestra de prueba en relación con la sustancia inicial. [6]
Hay algunos tipos comunes de espectrofotómetros que incluyen: Espectrofotómetro UV-vis: Mide la absorción de luz en los rangos UV y visible (200-800 nm). Se utiliza para la cuantificación de muchos compuestos orgánicos e inorgánicos. 1. Espectrofotómetro de infrarrojos: Mide la absorción de luz infrarroja, permitiendo la identificación de enlaces químicos y grupos funcionales. 2. Espectrofotómetro de absorción atómica (AAS): utiliza la absorción de luz por átomos de analito vaporizados para determinar concentraciones de metales y metaloides. 3. Espectrofotómetro de fluorescencia: Mide la intensidad de la luz fluorescente emitida por las muestras después de la excitación. Permite análisis altamente sensibles de muestras con fluorescencia nativa o inducida. 4. Colorímetro: Espectrofotómetros simples que se utilizan para medir la absorción de luz para ensayos y pruebas colorimétricas. [15]
La espectrofotometría es una técnica importante utilizada en muchos experimentos bioquímicos que involucran aislamiento de ADN, ARN y proteínas, cinética enzimática y análisis bioquímicos. [16] Dado que las muestras en estas aplicaciones no están disponibles en grandes cantidades, son especialmente adecuadas para ser analizadas en esta técnica no destructiva. Además, se pueden guardar muestras preciosas utilizando una plataforma de microvolúmenes en la que se requiere tan solo 1 uL de muestra para análisis completos. [17] Una breve explicación del procedimiento de espectrofotometría incluye comparar la absorbencia de una muestra en blanco que no contiene un compuesto coloreado con una muestra que contiene un compuesto coloreado. Esta coloración se puede lograr mediante un tinte como el tinte Coomassie Brilliant Blue G-250 medido a 595 nm o mediante una reacción enzimática como se ve entre la β-galactosidasa y ONPG (vuelve la muestra amarilla) medida a 420 nm. [3] : 21–119 El espectrofotómetro se utiliza para medir compuestos coloreados en la región visible de la luz (entre 350 nm y 800 nm), [3] : 65 por lo que se puede utilizar para encontrar más información sobre la sustancia que se está estudiando. En los experimentos bioquímicos, se elige una propiedad química y/o física y el procedimiento que se utiliza es específico de esa propiedad para obtener más información sobre la muestra, como la cantidad, pureza, actividad enzimática, etc. La espectrofotometría se puede utilizar para una varias técnicas, como determinar la absorbancia de longitud de onda óptima de las muestras, determinar el pH óptimo para la absorbancia de las muestras, determinar concentraciones de muestras desconocidas y determinar el pKa de varias muestras. [3] : 21–119 La espectrofotometría también es un proceso útil para la purificación de proteínas [18] y también se puede utilizar como método para crear ensayos ópticos de un compuesto. Los datos espectrofotométricos también se pueden utilizar junto con la ecuación de Beer-Lambert, para determinar diversas relaciones entre transmitancia y concentración, y absorbancia y concentración. [3] : 21–119 Debido a que un espectrofotómetro mide la longitud de onda de un compuesto a través de su color, se puede agregar una sustancia que se une al colorante para que pueda sufrir un cambio de color y medirse. [19] Es posible conocer las concentraciones de una mezcla de dos componentes utilizando los espectros de absorción de las soluciones estándar de cada componente. Para ello es necesario conocer el coeficiente de extinción de esta mezcla a dos longitudes de onda y los coeficientes de extinción de soluciones que contienen los pesos conocidos de los dos componentes. [20]Además del modelo tradicional de ley de Beer-Lamberts, se puede utilizar espectroscopía sin etiquetas basada en cubetas, que agrega un filtro óptico en los caminos de la luz, lo que permite al espectrofotómetro cuantificar la concentración, el tamaño y el índice de refracción de las muestras siguiendo la ley de las manos. [21] Los espectrofotómetros se han desarrollado y mejorado durante décadas y han sido ampliamente utilizados entre los químicos. Además, los espectrofotómetros están especializados en medir valores de absorbancia de longitud de onda de luz visible o UV. [3] : 21–119 Se considera un instrumento muy preciso que también es muy sensible y, por lo tanto, extremadamente preciso, especialmente para determinar el cambio de color. [22] Este método también es conveniente para su uso en experimentos de laboratorio porque es un proceso económico y relativamente simple.
La mayoría de los espectrofotómetros se utilizan en las regiones ultravioleta y visible del espectro, y algunos de estos instrumentos también funcionan en la región del infrarrojo cercano. La concentración de una proteína se puede estimar midiendo la DO a 280 nm debido a la presencia de triptófano, tirosina y fenilalanina. Este método no es muy preciso ya que la composición de las proteínas varía mucho y las proteínas que no contienen ninguno de estos aminoácidos no tienen una absorción máxima a 280 nm. La contaminación por ácidos nucleicos también puede interferir. Este método requiere un espectrofotómetro capaz de medir en la región UV con cubetas de cuarzo. [3] : 135
La espectroscopia ultravioleta-visible (UV-vis) implica niveles de energía que excitan transiciones electrónicas. La absorción de luz UV-vis excita las moléculas que se encuentran en estados fundamentales a sus estados excitados. [5]
La espectrofotometría de región visible de 400 a 700 nm se utiliza ampliamente en la ciencia de la colorimetría . Es un hecho conocido que funciona mejor en el rango de 0,2 a 0,8 DE. Los fabricantes de tinta, las imprentas, los proveedores de textiles y muchos más necesitan los datos proporcionados mediante colorimetría. Toman lecturas en la región de cada 5 a 20 nanómetros a lo largo de la región visible y producen una curva de reflectancia espectral o un flujo de datos para presentaciones alternativas. Estas curvas se pueden utilizar para probar un nuevo lote de colorante y comprobar si coincide con las especificaciones, por ejemplo, los estándares de impresión ISO.
Los espectrofotómetros de región visible tradicionales no pueden detectar si un colorante o el material base tiene fluorescencia. Esto puede dificultar la gestión de los problemas de color si, por ejemplo, una o más tintas de impresión son fluorescentes. Cuando un colorante contiene fluorescencia, se utiliza un espectrofotómetro de fluorescencia biespectral. Hay dos configuraciones principales para los espectrofotómetros de espectro visual, d/8 (esférico) y 0/45. Los nombres se deben a la geometría de la fuente de luz, del observador y del interior de la cámara de medición. Los científicos utilizan este instrumento para medir la cantidad de compuestos en una muestra. Si el compuesto está más concentrado, la muestra absorberá más luz; dentro de rangos pequeños, se cumple la ley de Beer-Lambert y la absorbancia entre muestras varía linealmente con la concentración. En el caso de las mediciones de impresión, se utilizan comúnmente dos configuraciones alternativas: sin/con filtro UV para controlar mejor el efecto de los abrillantadores UV dentro del papel.
Las muestras suelen prepararse en cubetas ; Dependiendo de la región de interés, pueden estar construidos de vidrio , plástico (región de interés del espectro visible) o cuarzo (región de interés del espectro UV lejano). Algunas aplicaciones requieren mediciones de volúmenes pequeños que se pueden realizar con plataformas de microvolúmenes.
Como se describe en la sección de aplicaciones, la espectrofotometría se puede utilizar en análisis tanto cualitativos como cuantitativos de ADN, ARN y proteínas. Se puede utilizar el análisis cualitativo y los espectrofotómetros se utilizan para registrar espectros de compuestos escaneando regiones de longitud de onda amplia para determinar las propiedades de absorbancia (la intensidad del color) del compuesto en cada longitud de onda. [5] Un experimento que puede demostrar los diversos usos que puede tener la espectrofotometría visible es la separación de β-galactosidasa de una mezcla de varias proteínas. En gran medida, la espectrofotometría se utiliza mejor para ayudar a cuantificar la cantidad de purificación a la que se ha sometido su muestra en relación con la concentración total de proteínas. Al realizar una cromatografía de afinidad, la B-galactosidasa se puede aislar y analizar haciendo reaccionar las muestras recolectadas con orto-nitrofenil-β-galactósido (ONPG) y determinando si la muestra se vuelve amarilla. [3] : 21–119 Después de probar la muestra a 420 nm para determinar la interacción específica con ONPG y a 595 para un ensayo de Bradford, la cantidad de purificación se puede evaluar cuantitativamente. [3] : 21–119 Además de esta espectrofotometría, se puede utilizar junto con otras técnicas, como la electroforesis SDS-Page, para purificar y aislar varias muestras de proteínas.
Los espectrofotómetros diseñados para la región infrarroja son bastante diferentes debido a los requisitos técnicos de medición en esa región. Un factor importante es el tipo de fotosensores disponibles para diferentes regiones espectrales, pero la medición infrarroja también es un desafío porque prácticamente todo emite IR como radiación térmica, especialmente en longitudes de onda superiores a aproximadamente 5 μm.
Otra complicación es que bastantes materiales como el vidrio y el plástico absorben los infrarrojos, lo que los hace incompatibles como medio óptico. Los materiales ópticos ideales son las sales , que no absorben fuertemente. Las muestras para espectrofotometría IR se pueden untar entre dos discos de bromuro de potasio o triturarse con bromuro de potasio y prensarse hasta formar un gránulo. Cuando se van a medir soluciones acuosas, se utiliza cloruro de plata insoluble para construir la celda.
Los espectrorradiómetros , que funcionan casi como los espectrofotómetros de la región visible, están diseñados para medir la densidad espectral de iluminantes. Las aplicaciones pueden incluir evaluación y categorización de la iluminación para las ventas por parte del fabricante, o para que los clientes confirmen que la lámpara que decidieron comprar está dentro de sus especificaciones. Componentes:
