En biología molecular , la cuantificación de ácidos nucleicos se realiza comúnmente para determinar las concentraciones promedio de ADN o ARN presentes en una mezcla, así como su pureza. Las reacciones que utilizan ácidos nucleicos a menudo requieren cantidades y pureza particulares para un rendimiento óptimo. Hasta la fecha, los científicos utilizan dos enfoques principales para cuantificar o establecer la concentración de ácidos nucleicos (como el ADN o el ARN) en una solución. Se trata de cuantificación espectrofotométrica y etiquetado de fluorescencia UV en presencia de un tinte de ADN. [ cita necesaria ]
Una de las prácticas más utilizadas para cuantificar ADN o ARN es el uso de análisis espectrofotométrico mediante un espectrofotómetro . [1] Un espectrofotómetro es capaz de determinar las concentraciones medias de los ácidos nucleicos ADN o ARN presentes en una mezcla, así como su pureza.
El análisis espectrofotométrico se basa en el principio de que los ácidos nucleicos absorben la luz ultravioleta en un patrón específico. En el caso del ADN y el ARN, se expone una muestra a luz ultravioleta a una longitud de onda de 260 nanómetros (nm) y un fotodetector mide la luz que atraviesa la muestra. Parte de la luz ultravioleta pasará a través y parte será absorbida por el ADN/ARN. Cuanta más luz absorba la muestra, mayor será la concentración de ácido nucleico en la muestra. El efecto resultante es que llegará menos luz al fotodetector y esto producirá una mayor densidad óptica (OD).
Utilizando la ley de Beer-Lambert es posible relacionar la cantidad de luz absorbida con la concentración de la molécula absorbente. A una longitud de onda de 260 nm, el coeficiente de extinción promedio para el ADN bicatenario es 0,020 (μg/mL) −1 cm −1 , para el ADN monocatenario es 0,027 (μg/mL) −1 cm −1 , para el ADN simple El ARN monocatenario es 0,025 (μg/mL) −1 cm −1 y, para oligonucleótidos monocatenarios cortos, depende de la longitud y la composición de bases. Por tanto, una absorbancia (A) de 1 corresponde a una concentración de 50 μg/ml para ADN bicatenario. Este método de cálculo es válido para una A de al menos 2. [2] Es posible que se necesite un coeficiente de extinción más preciso para los oligonucleótidos; estos se pueden predecir utilizando el modelo del vecino más cercano. [3]
La densidad óptica [4] se genera a partir de la ecuación:
En términos prácticos, una muestra que no contiene ADN ni ARN no debería
absorber nada de luz ultravioleta y, por lo tanto, producir una DO de 0.
Densidad óptica= Log (100/100)=0
Cuando se utiliza el análisis espectrofotométrico para determinar la concentración de ADN o ARN, se utiliza la ley de Beer-Lambert para determinar concentraciones desconocidas sin necesidad de curvas estándar. En esencia, la Ley de Beer-Lambert permite relacionar la cantidad de luz absorbida con la concentración de la molécula absorbente. Las siguientes unidades de absorbancia a factores de conversión de concentración de ácido nucleico se utilizan para convertir la DO en concentración de muestras de ácido nucleico desconocidas: [5]
Cuando utilice una longitud de paso de 10 mm , simplemente multiplique el OD por el factor de conversión para determinar la concentración. Por ejemplo, una muestra de ADNds de DO 2,0 corresponde a una muestra con una concentración de 100 μg/ml.
Cuando se utiliza una longitud de recorrido inferior a 10 mm, el diámetro exterior resultante se reducirá en un factor de 10/longitud de recorrido. Utilizando el ejemplo anterior con una longitud de paso de 3 mm, la DO para la muestra de 100 μg/ml se reduciría a 0,6. Para normalizar la concentración a un equivalente de 10 mm, se hace lo siguiente:
0,6 DOX (10/3) * 50 µg/ml = 100 µg/ml
La mayoría de los espectrofotómetros permiten la selección del tipo de ácido nucleico y la longitud del camino de manera que la concentración resultante se normalice a la longitud del camino de 10 mm, que se basa en los principios de la ley de Beer .
La "unidad A260" se utiliza como medida cuantitativa para los ácidos nucleicos. Una unidad A260 es la cantidad de ácido nucleico contenida en 1 ml y que produce una DO de 1. Se aplican los mismos factores de conversión y, por lo tanto, en tales contextos:
Es común que las muestras de ácido nucleico estén contaminadas con otras moléculas (es decir, proteínas, compuestos orgánicos, etc.). El beneficio secundario de utilizar el análisis espectrofotométrico para la cuantificación de ácidos nucleicos es la capacidad de determinar la pureza de la muestra mediante el cálculo de 260 nm:280 nm. La relación de absorbancia a 260 y 280 nm (A 260/280 ) se utiliza para evaluar la pureza de los ácidos nucleicos. Para el ADN puro, A 260/280 se considera ampliamente ~1,8, pero se ha argumentado que se traduce (debido a errores numéricos en el artículo original de Warburg) en una mezcla de 60% de proteína y 40% de ADN. [6] La proporción para ARN puro A 260/280 es ~2,0. Estas proporciones se utilizan comúnmente para evaluar la cantidad de contaminación proteica que queda del proceso de aislamiento del ácido nucleico, ya que las proteínas se absorben a 280 nm.
La relación de absorbancia a 260 nm frente a 280 nm se usa comúnmente para evaluar la contaminación del ADN de soluciones de proteínas , ya que las proteínas (en particular, los aminoácidos aromáticos) absorben luz a 280 nm. [2] [7] Sin embargo, lo contrario no es cierto: se necesita una cantidad relativamente grande de contaminación proteica para afectar significativamente la proporción 260:280 en una solución de ácido nucleico. [2] [6]
La proporción 260:280 tiene una alta sensibilidad a la contaminación de ácidos nucleicos en proteínas:
La proporción 260:280 carece de sensibilidad a la contaminación de proteínas en los ácidos nucleicos (la tabla que se muestra para ARN, 100 % de ADN es aproximadamente 1,8):
Esta diferencia se debe al coeficiente de atenuación de masa mucho mayor que tienen los ácidos nucleicos a 260 nm y 280 nm, en comparación con el de las proteínas. Debido a esto, incluso para concentraciones relativamente altas de proteína, la proteína contribuye relativamente poco a la absorbancia de 260 y 280. Si bien la contaminación proteica no se puede evaluar de manera confiable con una proporción de 260:280, esto también significa que contribuye con poco error a la estimación de la cantidad de ADN.
El examen de los espectros de la muestra puede resultar útil para identificar que existe un problema con la pureza de la muestra.
Un método alternativo para evaluar la concentración de ADN y ARN es etiquetar la muestra con una etiqueta fluorescente , que es un tinte fluorescente que se utiliza para medir la intensidad de los tintes que se unen a los ácidos nucleicos y emiten fluorescencia selectiva cuando se unen (por ejemplo, bromuro de etidio ). Este método es útil para los casos en los que la concentración es demasiado baja para evaluarla con precisión mediante espectrofotometría y en los casos en que los contaminantes que se absorben a 260 nm hacen imposible una cuantificación precisa mediante ese método. El beneficio de la cuantificación por fluorescencia de ADN y ARN es la sensibilidad mejorada con respecto al análisis espectrofotométrico . Sin embargo, ese aumento en la sensibilidad tiene el costo de un precio más alto por muestra y un proceso de preparación de muestras más prolongado .
Hay dos formas principales de abordar esto. El "manchado" implica colocar una muestra directamente sobre un gel de agarosa o una envoltura de plástico . El tinte fluorescente está presente en el gel de agarosa o se añade en concentraciones apropiadas a las muestras en la película plástica. Junto a la muestra se coloca un conjunto de muestras con concentraciones conocidas. Luego se estima la concentración de la muestra desconocida comparándola con la fluorescencia de estas concentraciones conocidas. Alternativamente, se puede pasar la muestra a través de un gel de agarosa o poliacrilamida , junto con algunas muestras de concentración conocida. Al igual que con la prueba puntual, la concentración se estima mediante la comparación de la intensidad fluorescente con las muestras conocidas. [2]
Si los volúmenes de muestra son lo suficientemente grandes como para usar microplacas o cubetas , las muestras cargadas de tinte también se pueden cuantificar con un fotómetro de fluorescencia . El volumen mínimo de muestra comienza en 0,3 μL. [10]
Hasta la fecha no existe ningún método de fluorescencia para determinar la contaminación proteica de una muestra de ADN que sea similar a la versión espectrofotométrica de 260 nm/280 nm.