La cromatografía de permeación en gel ( GPC ) [1] es un tipo de cromatografía de exclusión por tamaño (SEC), que separa analitos de alto peso molecular o coloidales en función del tamaño o diámetro, típicamente en solventes orgánicos. La técnica se utiliza a menudo para el análisis de polímeros . Como técnica, SEC fue desarrollada por primera vez en 1955 por Lathe y Ruthven. [2] El término cromatografía de permeación en gel se remonta a JC Moore de Dow Chemical Company , quien investigó la técnica en 1964. [3] La tecnología de columna patentada fue licenciada a Waters Corporation , quien posteriormente comercializó esta tecnología en 1964. [4] Los sistemas y consumibles de GPC ahora también están disponibles de varios fabricantes. A menudo es necesario separar polímeros, tanto para analizarlos como para purificar el producto deseado.
Al caracterizar polímeros, es importante considerar su distribución de tamaño y dispersividad ( Đ ), así como su peso molecular . Los polímeros se pueden caracterizar mediante una variedad de definiciones de peso molecular, incluido el peso molecular promedio en número (M n ), el peso molecular promedio en peso (M w ) (ver distribución de masa molar ), el peso molecular promedio en tamaño (M z ) o el peso molecular de viscosidad (M v ). La GPC permite la determinación de Đ, así como de M v y, en función de otros datos, se pueden determinar M n , M w y M z .
La GPC es un tipo de cromatografía en la que se separan los analitos en función de su tamaño o volumen hidrodinámico ( radio de giro ). Esto difiere de otras técnicas cromatográficas, que dependen de interacciones químicas o físicas entre las fases móvil y estacionaria para separar los analitos. [5] La separación se produce mediante el uso de perlas de gel poroso empaquetadas dentro de una columna (ver fase estacionaria (química) ). El principio de separación se basa en la exclusión o inclusión diferencial de las macromoléculas por la fase estacionaria de gel poroso. Las moléculas más grandes se excluyen de entrar en los poros y eluyen antes, mientras que las moléculas más pequeñas pueden entrar en los poros, permaneciendo así más tiempo dentro de la columna. Todo el proceso se lleva a cabo sin ninguna interacción de los analitos con la superficie de la fase estacionaria.
Los analitos más pequeños en relación con el tamaño de los poros pueden atravesar estos poros y pasar más tiempo dentro de las partículas de gel, lo que aumenta su tiempo de retención. Por el contrario, los analitos más grandes en relación con el tamaño de los poros pasan poco tiempo dentro de la columna, por lo que se eluyen antes. Cada tipo de columna tiene un rango de pesos moleculares que se pueden separar, según el tamaño de sus poros.
Si un analito es demasiado grande en relación con los poros de la columna, no será retenido en absoluto y será totalmente excluido; por el contrario, si el analito es pequeño en relación con el tamaño de los poros, será totalmente permeable. Los analitos que son totalmente excluidos, eluyen con el volumen libre fuera de las partículas (V o ), el límite de exclusión total, mientras que los analitos que son completamente retardados, eluyen con el solvente, marcando el volumen de permeación total de la columna, incluyendo también el solvente retenido dentro de los poros (V i ). El volumen total puede considerarse mediante la siguiente ecuación, donde V g es el volumen del gel de polímero y V t es el volumen total: [5]
Como se puede inferir, existe un rango limitado de pesos moleculares que se pueden separar con cada columna, por lo tanto, el tamaño de los poros para el relleno debe elegirse de acuerdo con el rango de peso molecular de los analitos que se van a separar. Para las separaciones de polímeros, los tamaños de poro deben ser del orden de los polímeros que se analizan. Si una muestra tiene un rango amplio de peso molecular, puede ser necesario utilizar varias columnas GPC con volúmenes de poro variables en tándem para resolver la muestra por completo.
La GPC se utiliza a menudo para determinar el peso molecular relativo de las muestras de polímeros, así como la distribución de pesos moleculares. Lo que la GPC mide realmente es el volumen molecular y la función de forma tal como se define por la viscosidad intrínseca . Si se utilizan estándares comparables, estos datos relativos se pueden utilizar para determinar pesos moleculares con una precisión de ± 5%. Los estándares de poliestireno con dispersidades inferiores a 1,2 se utilizan normalmente para calibrar la GPC. [6] Desafortunadamente, el poliestireno tiende a ser un polímero muy lineal y, por lo tanto, como estándar solo es útil compararlo con otros polímeros que se sabe que son lineales y de tamaño relativamente similar.
La cromatografía de permeación en gel se lleva a cabo casi exclusivamente en sistemas cromatográficos . El diseño experimental no es muy diferente de otras técnicas de cromatografía líquida de alto rendimiento . Las muestras se disuelven en un disolvente adecuado, en el caso de la GPC, estos tienden a ser disolventes orgánicos y, después de filtrar la solución, se inyecta en una columna. La separación de la mezcla de múltiples componentes tiene lugar en la columna. El suministro constante de eluyente fresco a la columna se logra mediante el uso de una bomba. Dado que la mayoría de los analitos no son visibles a simple vista, se necesita un detector. A menudo, se utilizan varios detectores para obtener información adicional sobre la muestra de polímero. La disponibilidad de un detector hace que el fraccionamiento sea conveniente y preciso.
Los geles se utilizan como fase estacionaria para GPC. El tamaño de poro de un gel debe controlarse cuidadosamente para poder aplicar el gel a una separación determinada. Otras propiedades deseables del agente formador de gel son la ausencia de grupos ionizantes y, en un disolvente determinado, la baja afinidad por las sustancias que se van a separar. Los geles comerciales como PLgel y Styragel (poliestireno-divinilbenceno reticulado), [7] [8] LH-20 ( Sephadex hidroxipropilado ), [9] Bio-Gel ( poliacrilamida reticulada ), HW-20 y HW-40 ( polímero metacrílico hidroxilado ), [10] y el gel de agarosa se utilizan a menudo en función de los diferentes requisitos de separación. [11]
La columna utilizada para GPC se rellena con un material de relleno microporoso y con el gel. Dado que el volumen de penetración total es el volumen máximo permeado por los analitos y no hay retención en la superficie de la fase estacionaria, el volumen total de la columna suele ser grande en relación con el volumen de la muestra.
El eluyente (fase móvil) debe ser el disolvente apropiado para disolver el polímero, no debe interferir con la respuesta del polímero analizado y debe humedecer la superficie del empaque y hacerla inerte a las interacciones con los polímeros. Los eluyentes más comunes para polímeros que se disuelven a temperatura ambiente en GPC son tetrahidrofurano (THF), o -diclorobenceno y triclorobenceno a 130–150 °C para polialquinos cristalinos y hexafluoroisopropanol (HFIP) para polímeros de condensación cristalinos como poliamidas y poliésteres . [12]
Existen dos tipos de bombas disponibles para el suministro uniforme de volúmenes de líquido relativamente pequeños para GPC: bombas de pistón o peristálticas. El suministro de un caudal constante sin fluctuaciones es especialmente importante para la precisión del análisis GPC, ya que el caudal se utiliza para la calibración del peso molecular o el diámetro. [13]
En la GPC, la concentración en peso del polímero en el disolvente de elución se puede controlar de forma continua con un detector. Hay muchos tipos de detectores disponibles y se pueden dividir en dos categorías principales. La primera son los detectores sensibles a la concentración, que incluyen la absorción UV-VIS, los detectores de refractómetro diferencial (DRI) o de índice de refracción (RI), la absorción infrarroja (IR) y los detectores de densidad. La segunda categoría son los detectores sensibles al peso molecular, que incluyen los detectores de dispersión de luz de ángulo bajo (LALLS) y los de dispersión de luz de ángulo múltiple (MALS). [14] Por lo tanto, el cromatograma resultante es una distribución de peso del polímero en función del volumen de retención.
El detector más sensible es el fotómetro UV diferencial y el detector más común es el refractómetro diferencial (DRI). Al caracterizar un copolímero, es necesario tener dos detectores en serie. [6] Para determinar con precisión la composición del copolímero, al menos dos de esos detectores deben ser detectores de concentración. [14] La determinación de la mayoría de las composiciones de copolímeros se realiza utilizando detectores UV y RI, aunque se pueden utilizar otras combinaciones. [15]
La cromatografía de permeación en gel (GPC) se ha convertido en la técnica más utilizada para analizar muestras de polímeros con el fin de determinar sus pesos moleculares y distribuciones de pesos. A la izquierda se muestran ejemplos de cromatogramas de GPC de muestras de poliestireno con sus pesos moleculares y dispersidades .
Benoit y colaboradores [16] propusieron que el volumen hidrodinámico, V η , que es proporcional al producto de [η] y M, donde [η] es la viscosidad intrínseca del polímero en el eluyente SEC, se puede utilizar como parámetro de calibración universal. Si se conocen las constantes de Mark–Houwink–Sakurada K y α (consulte la ecuación de Mark–Houwink ), un gráfico de log [η]M versus volumen de elución (o tiempo de elución) para un solvente, columna e instrumento en particular proporciona una curva de calibración universal que se puede utilizar para cualquier polímero en ese solvente. Al determinar los volúmenes (o tiempos) de retención de estándares de polímeros monodispersos (por ejemplo, soluciones de poliestireno monodisperso en THF), se puede obtener una curva de calibración al trazar el logaritmo del peso molecular versus el tiempo o volumen de retención. Una vez obtenida la curva de calibración, se puede obtener el cromatograma de permeación en gel de cualquier otro polímero en el mismo disolvente y se pueden determinar los pesos moleculares (normalmente M n y M w ) y la distribución completa de pesos moleculares del polímero. A la derecha se muestra una curva de calibración típica y se puede obtener el peso molecular de una muestra desconocida a partir de la curva de calibración.
Como técnica de separación, la GPC tiene muchas ventajas. En primer lugar, tiene un tiempo de separación bien definido debido al hecho de que hay un volumen de elución final para todos los analitos no retenidos. Además, la GPC puede proporcionar bandas estrechas, aunque este aspecto de la GPC es más difícil para las muestras de polímeros que tienen amplios rangos de pesos moleculares presentes. Finalmente, dado que los analitos no interactúan químicamente o físicamente con la columna, hay una menor probabilidad de que se produzca una pérdida de analito. [5] Para investigar las propiedades de las muestras de polímeros en particular, la GPC puede ser muy ventajosa. La GPC proporciona un método más conveniente para determinar los pesos moleculares de los polímeros. De hecho, la mayoría de las muestras se pueden analizar a fondo en una hora o menos. [17] Otros métodos utilizados en el pasado eran la extracción fraccionada y la precipitación fraccionada. Como estos procesos eran bastante laboriosos, los pesos moleculares y las distribuciones de masas normalmente no se analizaban. [18] Por lo tanto, la GPC ha permitido la estimación rápida y relativamente fácil de los pesos moleculares y la distribución de las muestras de polímeros.
Sin embargo, la GPC tiene sus desventajas. En primer lugar, hay un número limitado de picos que se pueden resolver en la corta escala de tiempo de la ejecución de la GPC. Además, como técnica, la GPC requiere alrededor de una diferencia de peso molecular de al menos el 10 % para que se produzca una resolución razonable de los picos. [5] En lo que respecta a los polímeros, las masas moleculares de la mayoría de las cadenas estarán demasiado próximas para que la separación por GPC muestre algo más que picos amplios. Otra desventaja de la GPC para polímeros es que se deben realizar filtraciones antes de utilizar el instrumento para evitar que el polvo y otras partículas arruinen las columnas e interfieran con los detectores. Aunque es útil para proteger el instrumento, existe la posibilidad de que la prefiltración de la muestra elimine la muestra de mayor peso molecular antes de que pueda cargarse en la columna. Otra posibilidad para superar estos problemas es la separación por fraccionamiento de flujo de campo (FFF).
El fraccionamiento por flujo de campo (FFF) puede considerarse como una alternativa a la GPC, especialmente cuando las partículas o los polímeros de masa molar alta causan obstrucción de la columna, la degradación por cizallamiento es un problema o se produce aglomeración pero no se puede hacer visible. El FFF es una separación en un canal de flujo abierto sin tener una fase estática involucrada, por lo que no ocurren interacciones. Con una versión de fraccionamiento por flujo de campo, el fraccionamiento por flujo de campo térmico , es posible la separación de polímeros que tienen el mismo tamaño pero diferentes composiciones químicas. [19]
