La microscopía de campo oscuro (también llamada microscopía de fondo oscuro ) describe métodos de microscopía , tanto en microscopía óptica como electrónica , que excluyen el haz no disperso de la imagen. En consecuencia, el campo alrededor de la muestra (es decir, donde no hay ninguna muestra que disperse el haz) es generalmente oscuro.
En los microscopios ópticos se debe utilizar una lente de condensador de campo oscuro, que dirige un cono de luz lejos de la lente del objetivo. Para maximizar el poder de captación de luz dispersa de la lente del objetivo, se utiliza inmersión en aceite y la apertura numérica (NA) de la lente del objetivo debe ser inferior a 1,0. Se pueden utilizar lentes objetivos con una NA más alta, pero sólo si tienen un diafragma ajustable, lo que reduce la NA. A menudo, estas lentes objetivas tienen una NA que varía de 0,7 a 1,25. [1]
En microscopía óptica , el campo oscuro describe una técnica de iluminación utilizada para mejorar el contraste en muestras no teñidas . Funciona iluminando la muestra con luz que no será recogida por la lente del objetivo y, por tanto, no formará parte de la imagen. Esto produce la apariencia clásica de un fondo oscuro, casi negro, con objetos brillantes sobre él.
Los pasos se ilustran en la figura donde se utiliza un microscopio invertido .
La microscopía de campo oscuro es una técnica muy simple pero efectiva y muy adecuada para usos que involucran muestras biológicas vivas y sin teñir , como un frotis de un cultivo de tejido u organismos unicelulares individuales, transmitidos por el agua. Teniendo en cuenta la simplicidad de la configuración, la calidad de las imágenes obtenidas con esta técnica es impresionante.
Una limitación de la microscopía de campo oscuro son los bajos niveles de luz que se observan en la imagen final. Esto significa que la muestra debe estar muy iluminada, lo que puede causar daños a la muestra.
Las técnicas de microscopía de campo oscuro están casi completamente libres de halos o artefactos en relieve típicos de la microscopía de contraste de interferencia diferencial . Esto se produce a expensas de la sensibilidad a la información de fase.
La interpretación de las imágenes de campo oscuro debe realizarse con mucho cuidado, ya que las características oscuras comunes de las imágenes de microscopía de campo brillante pueden ser invisibles y viceversa. En general, la imagen de campo oscuro carece de las bajas frecuencias espaciales asociadas con la imagen de campo brillante, lo que hace que la imagen sea una versión de paso alto de la estructura subyacente.
Si bien la imagen de campo oscuro puede parecer al principio un negativo de la imagen de campo brillante, en cada una se ven efectos diferentes. En la microscopía de campo brillante, las características son visibles cuando la luz incidente proyecta una sombra sobre la superficie o una parte de la superficie es menos reflectante, posiblemente por la presencia de hoyos o rayones. Las características elevadas que son demasiado suaves para proyectar sombras no aparecerán en imágenes de campo brillante, pero la luz que se refleja en los lados de la característica será visible en las imágenes de campo oscuro.
La microscopía de campo oscuro se ha aplicado recientemente en dispositivos señaladores de mouse de computadora para permitir que el mouse trabaje sobre vidrio transparente al obtener imágenes de defectos microscópicos y polvo en la superficie del vidrio.
Cuando se combina con imágenes hiperespectrales , la microscopía de campo oscuro se convierte en una poderosa herramienta para la caracterización de nanomateriales incrustados en las células. En una publicación reciente, Patskovsky et al. utilizó esta técnica para estudiar la unión de nanopartículas de oro (AuNP) dirigidas a células cancerosas CD44 +. [2]
Los estudios de campo oscuro en microscopía electrónica de transmisión desempeñan un papel importante en el estudio de cristales y defectos cristalinos, así como en la obtención de imágenes de átomos individuales.
Brevemente, la obtención de imágenes [3] implica inclinar la iluminación incidente hasta que un haz difractado, en lugar del incidente, pasa a través de una pequeña apertura del objetivo en el plano focal posterior de la lente del objetivo. Las imágenes de campo oscuro, en estas condiciones, permiten mapear la intensidad difractada proveniente de una única colección de planos difractores en función de la posición proyectada sobre la muestra y en función de la inclinación de la muestra.
En especímenes monocristalinos, las imágenes de campo oscuro de reflexión única de un espécimen inclinado justo fuera de la condición de Bragg permiten "iluminar" sólo aquellos defectos de la red, como dislocaciones o precipitados, que doblan un único conjunto de planos de la red en su vecindad. . Luego se puede utilizar el análisis de intensidades en dichas imágenes para estimar la magnitud de esa flexión. En los especímenes policristalinos, por otro lado, las imágenes de campo oscuro sirven para iluminar sólo el subconjunto de cristales que reflejan Bragg en una orientación determinada.
La obtención de imágenes de haz débil implica una óptica similar a la del campo oscuro convencional, pero utiliza un armónico del haz difractado en lugar del haz difractado en sí. De esta manera, se puede obtener una resolución mucho mayor de las regiones tensas alrededor de los defectos.
Las imágenes anulares de campo oscuro requieren que uno forme imágenes con electrones difractados en una apertura anular centrada en el haz no disperso, pero sin incluirlo. Para ángulos de dispersión grandes en un microscopio electrónico de transmisión de barrido , esto a veces se denomina imagen de contraste Z debido a la dispersión mejorada de los átomos de alto número atómico.
Se trata de una técnica matemática intermedia entre el espacio directo y el recíproco (transformada de Fourier) para explorar imágenes con periodicidades bien definidas, como imágenes de franjas de celosía de microscopio electrónico. Al igual que con las imágenes analógicas de campo oscuro en un microscopio electrónico de transmisión, permite "iluminar" aquellos objetos en el campo de visión donde residen las periodicidades de interés. A diferencia de las imágenes analógicas de campo oscuro, también puede permitir mapear la fase de Fourier de las periodicidades y, por lo tanto, los gradientes de fase, que proporcionan información cuantitativa sobre la tensión de la red vectorial.
