Un cósmido es un tipo de plásmido híbrido que contiene una secuencia cos del fago Lambda . [1] Los cósmidos , que suelen emplearse como vectores de clonación en ingeniería genética , pueden utilizarse para construir bibliotecas genómicas . Fueron descritos por primera vez por Collins y Hohn en 1978. [2] Los cósmidos pueden contener de 37 a 52 (normalmente 45) kb de ADN, límites basados en el tamaño de empaquetamiento normal del bacteriófago. Pueden replicarse como plásmidos si tienen un origen de replicación (ori) adecuado: por ejemplo , el ori de SV40 en células de mamíferos, el ori de ColE1 para la replicación de ADN de doble cadena o el ori de f1 para la replicación de ADN de cadena sencilla en procariotas . Con frecuencia también contienen un gen para la selección, como la resistencia a los antibióticos , de modo que las células transformadas se pueden identificar colocándolas en un medio que contenga el antibiótico. Aquellas células que no absorbieran el cósmido no podrían crecer. [3]
A diferencia de los plásmidos, también pueden empaquetarse in vitro en cápsides de fagos , un paso que requiere extremos cohesivos , también conocidos como sitios cos , también utilizados en la clonación con un fago lambda como vector, sin embargo, casi todos los genes lambda han sido eliminados con la excepción de la secuencia cos . El ADN cósmido híbrido en las cápsides puede luego transferirse a células bacterianas por transducción . Dado que existe un requisito para el empaquetamiento in vitro por el cual se requieren al menos 38 kb de ADN entre los sitios cos, el vector sin ADN insertado no será empaquetado (la inestabilidad de los plásmidos aumenta si el nuevo ADN insertado contiene muchas repeticiones directas o ADN palindrómico (repeticiones invertidas). Esta inestabilidad puede contrarrestarse en gran medida utilizando una bacteria huésped con mutaciones específicas que afecten la recombinación del ADN (NB La ausencia de repeticiones invertidas se observó en la primera publicación de Hohn & Collins citada anteriormente; consulte también [4] ).
Las secuencias cos tienen una longitud de ~200 pares de bases y son esenciales para el empaquetamiento. Contienen un sitio cosN donde la terminasa corta el ADN en cada hebra, con 12 pb de separación. Esto provoca la linealización del cósmido circular con dos extremos "cohesivos" o "pegajosos" de 12 pb. (El ADN debe ser lineal para encajar en la cabeza de un fago). El sitio cosB retiene la terminasa mientras corta y separa las hebras. El sitio cosQ del siguiente cósmido (ya que la replicación por círculo rodante a menudo da como resultado concatémeros lineales ) es retenido por la terminasa después de que el cósmido anterior se haya empaquetado, para evitar la degradación por las DNasas celulares .
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Los cósmidos son predominantemente plásmidos con un oriV bacteriano , un marcador de selección de antibióticos y un sitio de clonación, pero llevan uno, o más recientemente dos, sitios cos derivados del bacteriófago lambda. Dependiendo del objetivo particular del experimento, están disponibles cósmidos de amplio espectro de hospedadores, cósmidos lanzadera o cósmidos "mamíferos" (ligados a oriV SV40 y marcadores de selección de mamíferos). La capacidad de carga de los cósmidos varía dependiendo del tamaño del propio vector, pero normalmente se encuentra alrededor de 40-45 kb. El procedimiento de clonación implica la generación de dos brazos del vector que luego se unen al ADN extraño. La selección contra el ADN cósmido de tipo salvaje se realiza simplemente mediante exclusión por tamaño. Los cósmidos, por lo tanto, siempre forman colonias y no placas. Además, la densidad de clones es mucho menor, alrededor de 10 5 – 10 6 UFC por μg de ADN ligado.
Después de la construcción de bibliotecas de lambda o cósmidos recombinantes, el ADN total se transfiere a un huésped de E. coli apropiado mediante una técnica llamada empaquetamiento in vitro. Los extractos de empaquetamiento necesarios se derivan de lisógenos cI857 de E. coli (red-gam-Sam y Dam (ensamblaje de cabeza) y Eam (ensamblaje de cola) respectivamente). Estos extractos reconocerán y empaquetarán las moléculas recombinantes in vitro , generando partículas de fago maduras (vectores basados en lambda) o plásmidos recombinantes contenidos en capas de fago (cósmidos). Estas diferencias se reflejan en las diferentes frecuencias de infección observadas a favor de los vectores de reemplazo de lambda. Esto compensa su capacidad de carga ligeramente menor. Las bibliotecas de fagos también se almacenan y seleccionan más fácilmente que las bibliotecas de cósmidos.
ADN objetivo: el ADN genómico que se va a clonar debe cortarse en fragmentos de restricción del tamaño adecuado. Esto se hace generalmente mediante una restricción parcial seguida de un fraccionamiento por tamaño o una desfosforilación (utilizando fosfatasa de intestino de ternera) para evitar la mezcla de cromosomas, es decir, la ligadura de fragmentos físicamente no ligados.
Los vectores más utilizados incluyen "SuperCos 1"