La replicación en círculo rodante ( RCR ) es un proceso de replicación unidireccional de ácido nucleico que puede sintetizar rápidamente múltiples copias de moléculas circulares de ADN o ARN , como los plásmidos , los genomas de los bacteriófagos y el genoma circular del ARN de los viroides . Algunos virus eucariotas también replican su ADN o ARN mediante el mecanismo del círculo rodante.
Como una versión simplificada de la replicación del círculo rodante natural, se desarrolló una técnica de amplificación de ADN isotérmica , la amplificación del círculo rodante. El mecanismo RCA es ampliamente utilizado en biología molecular y nanotecnología biomédica , especialmente en el campo de la biosensación (como método de amplificación de señales). [1]
La replicación del ADN en círculo rodante se inicia mediante una proteína iniciadora codificada por el ADN del plásmido o bacteriófago, que corta una hebra de la molécula de ADN circular de doble hebra en un sitio llamado origen de doble hebra o DSO. La proteína iniciadora permanece unida al extremo 5' fosfato de la cadena mellada y el extremo 3' hidroxilo libre se libera para servir como cebador para la síntesis de ADN mediante la ADN polimerasa III . Utilizando la hebra sin melladuras como plantilla, la replicación se produce alrededor de la molécula de ADN circular, desplazando la hebra mellada como ADN monocatenario. El desplazamiento de la hebra mellada se lleva a cabo mediante una helicasa codificada por el huésped llamada PcrA (abreviatura de copia reducida del plásmido) en presencia de la proteína de iniciación de la replicación del plásmido.
La síntesis continua de ADN puede producir múltiples copias lineales monocatenarias del ADN original en una serie continua de cabeza a cola llamada concatémero . Estas copias lineales se pueden convertir en moléculas circulares de doble cadena mediante el siguiente proceso:
Primero, la proteína iniciadora hace otra muesca en el ADN para terminar la síntesis de la primera cadena (principal). La ARN polimerasa y la ADN polimerasa III luego replican el ADN de origen monocatenario (SSO) para formar otro círculo bicatenario. La ADN polimerasa I elimina el cebador, reemplazándolo con ADN, y la ADN ligasa une los extremos para formar otra molécula de ADN circular bicatenario.
Como resumen, una replicación típica de un círculo rodante de ADN tiene cinco pasos: [2]
Algunos virus de ADN replican su información genómica en las células huésped mediante replicación en círculo rodante. Por ejemplo, el herpesvirus humano-6 (HHV-6)(hibv) expresa un conjunto de "genes tempranos" que se cree que están involucrados en este proceso. [3] Los concatémeros largos resultantes se escinden posteriormente entre las regiones pac-1 y pac-2 del genoma del HHV-6 mediante ribozimas cuando se empaquetan en viriones individuales. [4]
El virus del papiloma humano-16 (VPH-16) es otro virus que emplea replicación continua para producir descendencia a un ritmo elevado. El VPH-16 infecta las células epiteliales humanas y tiene un genoma circular bicatenario. Durante la replicación, en el origen, el hexámero E1 envuelve el ADN monocatenario y se mueve en dirección 3' a 5'. En la replicación bidireccional normal, las dos proteínas de replicación se disociarán en el momento de la colisión, pero en el VPH-16 se cree que el hexámero E1 no se disocia, lo que conduce a una replicación continua. Se cree que este mecanismo de replicación del VPH puede tener implicaciones fisiológicas en la integración del virus en el cromosoma del huésped y su eventual progresión hacia el cáncer de cuello uterino. [5]
Además, el geminivirus también utiliza la replicación en círculo rodante como mecanismo de replicación. Es un virus responsable de destruir muchos cultivos importantes, como la mandioca, el algodón, las legumbres, el maíz, el tomate y la okra. El virus tiene un ADN circular, monocatenario, que se replica en las células de la planta huésped. Todo el proceso es iniciado por la proteína iniciadora de la replicación geminiviral, Rep, que también es responsable de alterar el entorno del huésped para que actúe como parte de la maquinaria de replicación. Rep también es sorprendentemente similar a la mayoría de las otras proteínas iniciadoras de replicación rodantes de eubacterias, con la presencia de los motivos I, II y III en su extremo N. Durante la replicación del círculo rodante, el ssDNA del geminivirus se convierte en dsDNA y luego se une Rep al dsDNA en la secuencia de origen TAATATTAC. Después de que Rep, junto con otras proteínas de replicación, se une al dsDNA, forma un bucle de tallo donde el ADN luego se escinde en la secuencia nanomérica provocando un desplazamiento de la hebra. Este desplazamiento permite que la horquilla de replicación progrese en la dirección 3' a 5', lo que finalmente produce una nueva cadena de ADN ss y una cadena de ADN concatamérica. [6]
Los intermediarios de replicación del ADN del bacteriófago T4 incluyen estructuras concateméricas circulares y circulares ramificadas . [7] Estas estructuras probablemente reflejan un mecanismo de replicación de círculo rodante.
Algunos virus y viroides de ARN también replican su genoma mediante la replicación de ARN en círculo rodante. Para los viroides, existen dos vías alternativas de replicación del ARN que siguen respectivamente los miembros de la familia Pospivirodae (replicación asimétrica) y Avsunviroidae (replicación simétrica).
En la familia Pospiviroidae (similar a PSTVd), el ARN de cadena positiva circular es transcrito por una ARN polimerasa del huésped en cadenas oligoméricas negativas y luego en cadenas oligoméricas positivas. [8] Estas cadenas oligoméricas plus se escinden mediante una ARNasa del huésped y se ligan mediante una ARN ligasa del huésped para reformar el ARN circular monomérico de la cadena plus. Esto se denomina vía asimétrica de replicación del círculo rodante. Los viroides de la familia Avsunviroidae (tipo ASBVd) replican su genoma a través de la vía simétrica de replicación del círculo rodante. [9] En esta vía simétrica, las cadenas oligoméricas negativas primero se escinden y ligan para formar cadenas monoméricas negativas y luego se transcriben en cadenas oligoméricas positivas. Estas cadenas oligoméricas plus se escinden y ligan después para reformar la cadena monomérica plus. La vía de replicación simétrica recibió su nombre porque tanto las cadenas positivas como las negativas se producen de la misma manera.
La escisión de las hebras oligoméricas más y menos está mediada por la estructura de ribozima de cabeza de martillo autoescindible presente en Avsunviroidae, pero dicha estructura está ausente en Pospiviroidae. [10]
La forma derivada de replicación en círculo rodante se ha utilizado con éxito para la amplificación de ADN a partir de cantidades muy pequeñas de material de partida. [1] Esta técnica de amplificación se denomina amplificación de círculo rodante (RCA). A diferencia de las técnicas de amplificación de ADN convencionales, como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) , RCA es una técnica de amplificación de ácido nucleico isotérmica en la que la polimerasa agrega continuamente nucleótidos individuales a un cebador hibridado con una plantilla circular que da como resultado un ADN ss concatémero largo que contiene de decenas a cientos. de repeticiones en tándem (complementaria a la plantilla circular). [11]
Hay cinco componentes importantes necesarios para realizar una reacción RCA:
Las polimerasas utilizadas en RCA son la exoADN polimerasa Phi29 , Bst y Vent para la amplificación del ADN, y la ARN polimerasa T7 para la amplificación del ARN. Dado que la ADN polimerasa Phi29 tiene la mejor procesividad y capacidad de desplazamiento de hebras entre todas las polimerasas antes mencionadas, se ha utilizado con mayor frecuencia en reacciones RCA. A diferencia de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), la RCA se puede realizar a una temperatura constante (temperatura ambiente a 65 °C) tanto en solución libre como sobre objetivos inmovilizados (amplificación en fase sólida).
Por lo general, hay tres pasos involucrados en una reacción de ADN RCA:
RCA produce una amplificación lineal del ADN, ya que cada plantilla circular crece a una velocidad determinada durante un período de tiempo determinado. Para aumentar el rendimiento y lograr una amplificación exponencial como lo hace la PCR, se han investigado varios enfoques. Uno de ellos es la amplificación por círculo rodante hiperramificado o HRCA, donde se añaden y también se extienden cebadores que se hibridan con los productos RCA originales. [12] De esta manera, el RCA original crea más plantilla que puede amplificarse. Otra es la amplificación de círculo a círculo o C2CA, donde los productos RCA se digieren con una enzima de restricción y se ligan en nuevos moldes circulares usando un oligo de restricción, seguido de una nueva ronda de RCA con una mayor cantidad de moldes circulares para la amplificación. [13]
RCA puede amplificar un único evento de unión molecular más de mil veces, lo que lo hace particularmente útil para detectar objetivos con abundancia ultrabaja. Las reacciones RCA se pueden realizar no solo en entornos de solución libre, sino también en una superficie sólida como vidrio, micro o nanopartículas, placas de micropocillos, dispositivos de microfluidos o incluso tiras de papel. Esta característica lo convierte en una herramienta muy poderosa para amplificar señales en inmunoensayos en fase sólida (p. ej., ELISA ). De esta manera, RCA se está convirtiendo en una herramienta de amplificación de señales muy versátil con una amplia gama de aplicaciones en genómica, proteómica, diagnóstico y biodetección.
Immuno-RCA es un método de amplificación de señal isotérmica para la detección y cuantificación de proteínas de alta especificidad y alta sensibilidad. Esta técnica combina dos campos: RCA, que permite la amplificación de nucleótidos, e inmunoensayo, que utiliza anticuerpos específicos contra biomarcadores intracelulares o libres. Como resultado, el inmuno-RCA proporciona una señal amplificada específica (alta relación señal-ruido), lo que lo hace adecuado para detectar, cuantificar y visualizar marcadores proteicos de baja abundancia en inmunoensayos en fase líquida [14] [15] [16] y inmunohistoquímica .
Immuno-RCA sigue una reacción inmunoadsorbente típica en ELISA o tinción de tejidos por inmunohistoquímica. [17] Los anticuerpos de detección utilizados en la reacción inmuno-RCA se modifican uniendo un oligonucleótido de ADN ss en el extremo de las cadenas pesadas. Por lo tanto, la sección Fab (Fragmento, unión a antígeno) del anticuerpo de detección aún puede unirse a antígenos específicos y el oligonucleótido puede servir como cebador de la reacción RCA.
El procedimiento típico de inmuno-RCA mediado por anticuerpos es el siguiente:
1. Un anticuerpo de detección reconoce una diana proteica específica. Este anticuerpo también está unido a un cebador oligonucleotídico.
2. Cuando hay ADN circular, se hibrida y el cebador coincide con la secuencia complementaria del ADN circular.
3. La secuencia complementaria de la plantilla de ADN circular se copia cientos de veces y permanece unida al anticuerpo.
4. La salida RCA (ssDNA alargado) se detecta con sondas fluorescentes utilizando un microscopio fluorescente o un lector de microplacas.
Además del inmuno-RCA mediado por anticuerpos, el cebador ssDNA RCA también se puede conjugar con el extremo 3' de un aptámero de ADN. La cola del cebador se puede amplificar mediante amplificación por círculo rodante. El producto se puede visualizar a través del etiquetado del reportero fluorescente. [19] El proceso se ilustra en la figura de la derecha.
Varios derivados de RCA se utilizaron ampliamente en el campo de la biodetección. Por ejemplo, RCA se ha utilizado con éxito para detectar la existencia de ADN viral y bacteriano a partir de muestras clínicas, [20] [21], lo que resulta muy beneficioso para el diagnóstico rápido de enfermedades infecciosas . También se ha utilizado como método de amplificación de señales en chip para ensayos de micromatrices de ácido nucleico (tanto para ADN como para ARN) . [1]
Además de la función de amplificación en aplicaciones de biodetección, la técnica RCA también se puede aplicar a la construcción de nanoestructuras de ADN e hidrogeles de ADN. Los productos de RCA también se pueden utilizar como plantillas para el ensamblaje periódico de nanoespecies o proteínas, la síntesis de nanocables metálicos [22] y la formación de nanoislas. [1]