La microscopía de bombeo-sonda es una modalidad de obtención de imágenes ópticas no lineales que se utiliza en femtoquímica para estudiar reacciones químicas . Genera imágenes de alto contraste a partir de objetivos endógenos no fluorescentes. Tiene numerosas aplicaciones, entre ellas la ciencia de los materiales , la medicina y la restauración de obras de arte .
El método clásico de absorción no lineal utilizado por los microscopistas es la fluorescencia convencional de dos fotones , en la que dos fotones de una única fuente interactúan para excitar un fotoelectrón. El electrón emite entonces un fotón al volver a su estado fundamental. Este método de microscopía ha sido revolucionario en las ciencias biológicas debido a sus capacidades inherentes de seccionamiento óptico tridimensional.
La absorción de dos fotones es inherentemente un proceso no lineal : la intensidad de salida fluorescente es proporcional al cuadrado de la intensidad de la luz de excitación. Esto garantiza que la fluorescencia solo se genere dentro del foco de un haz láser, ya que la intensidad fuera de este plano es insuficiente para excitar un fotoelectrón. [1]
Sin embargo, esta modalidad de microscopio está inherentemente limitada por la cantidad de moléculas biológicas que pueden experimentar tanto excitación de dos fotones como fluorescencia . [2]
La microscopía de bombeo-sonda evita esta limitación midiendo directamente la luz de excitación. Esto amplía el número de objetivos potenciales para cualquier molécula capaz de absorber dos fotones, incluso si no emite fluorescencia al relajarse. [3] El método modula la amplitud de un haz láser pulsado , denominado bomba , para llevar la molécula objetivo a un estado excitado . Esto afectará las propiedades de un segundo haz coherente, denominado sonda , en función de la interacción de los dos haces con la molécula. Luego, un detector mide estas propiedades para formar una imagen.
Debido a que la microscopía de bombeo-sonda no depende de objetivos fluorescentes, la modalidad aprovecha múltiples tipos diferentes de absorción multifotónica.
La absorción de dos fotones (TPA) es un proceso de tercer orden en el que dos fotones son absorbidos casi simultáneamente por la misma molécula. Si un segundo fotón es absorbido por el mismo electrón dentro del mismo evento cuántico, el electrón entra en un estado excitado . [4]
Este es el mismo fenómeno que se utiliza en la microscopía de dos fotones (TPM), pero hay dos características clave que distinguen la microscopía de bombeo-sonda de la TPM. En primer lugar, dado que la molécula no es necesariamente fluorescente, un fotodetector mide la intensidad de la sonda. Por lo tanto, la señal disminuye a medida que se produce la absorción de dos fotones, lo que ocurre a la inversa de la TPM. [3]
En segundo lugar, la microscopía de bombeo-sonda utiliza fuentes separadas espectralmente para cada fotón, mientras que la microscopía de bombeo-sonda convencional utiliza una fuente de una sola longitud de onda. Esto se conoce como excitación degenerada de dos fotones. [3]
La absorción en estado excitado (ESA) ocurre cuando el haz de bombeo envía un electrón a un estado excitado, luego el haz de sonda envía el electrón a un estado excitado más alto. Esto difiere de TPA principalmente en la escala de tiempo en la que ocurre. Dado que un electrón puede permanecer en un estado excitado durante un período de nanosegundos , requiere duraciones de pulso más largas que TPA. [5]
La microscopía de bombeo-sonda también puede medir la emisión estimulada . En este caso, el haz de bombeo lleva al electrón a un estado excitado. Luego, el electrón emite un fotón cuando se expone al haz de sonda. Esta interacción aumenta la señal de la sonda en el sitio del detector.
El agotamiento del estado fundamental se produce cuando el haz de bombeo envía el electrón a un estado excitado. Sin embargo, a diferencia de lo que ocurre en la ESA, el haz de sonda no puede enviar un electrón a un estado excitado secundario. En cambio, envía los electrones restantes del estado fundamental al primer estado excitado. Sin embargo, dado que el haz de bombeo ha disminuido la cantidad de electrones en el estado fundamental, se absorben menos fotones de sonda y la señal de sonda aumenta en el sitio del detector. [3]
La modulación de fase cruzada es causada por el efecto Kerr , en el que el índice de refracción de la muestra cambia en presencia de un gran campo eléctrico. [6] En este caso, el haz de bombeo modula la fase de la sonda, que luego se puede medir a través de técnicas interferométricas . En ciertos casos, conocidos como desplazamiento espectral de modulación de fase cruzada , este cambio de fase induce un cambio en el espectro de bombeo que se puede detectar con un filtro espectral. [3]
La medición de interacciones ópticas no lineales requiere un alto nivel de potencia instantánea y una temporización muy precisa. Para lograr la gran cantidad de fotones necesarios para generar estas interacciones y evitar dañar muestras delicadas, estos microscopios requieren un láser con bloqueo de modo . Estos láseres pueden lograr recuentos de fotones muy altos en la escala de tiempo de femtosegundos y mantener una potencia promedio baja. La mayoría de los sistemas utilizan un medio de ganancia de titanio: zafiro debido a la amplia gama de longitudes de onda a las que puede acceder. [3] [7]
Por lo general, se utiliza la misma fuente para generar la bomba y la sonda. Se utiliza un oscilador paramétrico óptico (OPO) para convertir el haz de la sonda a la longitud de onda deseada. La longitud de onda de la sonda se puede ajustar en un amplio rango para aplicaciones espectroscópicas. [7]
Sin embargo, para ciertos tipos de interacciones de dos fotones, es posible utilizar fuentes pulsadas separadas. [3] Esto solo es posible con interacciones como la absorción en estado excitado, en la que los electrones permanecen en el estado excitado durante varios picosegundos. Sin embargo, es más común utilizar una única fuente de femtosegundos con dos trayectorias de haz separadas de diferentes longitudes para modular la sincronización entre los haces de bombeo y de sonda. [3] [7]
La amplitud del haz de bombeo se modula utilizando un modulador acústico-óptico o electro-óptico del orden de 10 7 Hz. Luego, los haces de bombeo y de sonda se recombinan utilizando un divisor de haz dicroico y se escanean utilizando espejos galvanométricos para generar imágenes punto por punto antes de enfocarse en la muestra. [3]
La señal generada por la modulación de la sonda es mucho más pequeña que el haz de bombeo original, por lo que ambos se separan espectralmente dentro de la ruta de detección mediante un espejo dicroico . La señal de la sonda se puede recolectar con muchos tipos diferentes de fotodetectores , normalmente un fotodiodo . Luego, la señal modulada se amplifica utilizando un amplificador de bloqueo sintonizado a la frecuencia de modulación de bombeo. [3]
De manera similar al análisis de datos hiperespectrales, los datos de imágenes de bombeo-sonda, conocidos como pila de retardo, deben procesarse para obtener una imagen con contraste molecular de las especies moleculares subyacentes. [3] El procesamiento de datos de bombeo-sonda es un desafío por varias razones; por ejemplo, las señales son bipolares (positivas y negativas), multiexponenciales y pueden alterarse significativamente por cambios sutiles en el entorno químico. [8] [9] Los principales métodos para el análisis de datos de bombeo-sonda son el ajuste multiexponencial, el análisis de componentes principales y el análisis fasorial . [3] [7]
En el ajuste multiexponencial, las curvas resueltas en el tiempo se ajustan con un modelo de decaimiento exponencial para determinar las constantes de decaimiento. Si bien este método es sencillo, tiene poca precisión. [7]
El análisis de componentes principales (PCA) fue uno de los primeros métodos utilizados para el análisis de datos de bombeo-sonda, ya que se utiliza comúnmente para el análisis de datos hiperespectrales. El PCA descompone los datos en componentes ortogonales. En estudios de melanoma , los componentes principales han demostrado una buena concordancia con las señales obtenidas de las diferentes formas de melanina . [10] Una ventaja del PCA es que el ruido se puede reducir manteniendo solo los componentes principales que explican la mayoría de la varianza en los datos. Sin embargo, los componentes principales no reflejan necesariamente las propiedades reales de las especies químicas subyacentes, que normalmente no son ortogonales. [3] Por lo tanto, una limitación es que no se puede inferir el número de especies químicas únicas utilizando PCA. [3]
El análisis fasorial se utiliza comúnmente para el análisis de datos de microscopía de imágenes de vida útil de fluorescencia (FLIM) [11] y se ha adaptado para el análisis de datos de imágenes de bombeo-sonda. [8] Las señales se descomponen en sus partes reales e imaginarias de la transformada de Fourier a una frecuencia dada. Al trazar las partes reales e imaginarias una contra la otra, se puede mapear la distribución de diferentes cromóforos con diferentes vidas útiles. [3] [7] En estudios de melanoma, este enfoque ha demostrado nuevamente poder distinguir entre las diferentes formas de melanina. [8] Una de las principales ventajas del análisis fasorial es que proporciona una vista gráfica cualitativa intuitiva del contenido [7] También se ha combinado con PCA para el análisis cuantitativo. [12]
El desarrollo de técnicas de obtención de imágenes por bombeo-sonda de alta velocidad y alta sensibilidad ha permitido su aplicación en diversos campos, como la ciencia de los materiales, la biología y el arte. [3] [7]
La obtención de imágenes por bombeo-sonda es ideal para el estudio y la caracterización de nanomateriales, como el grafeno, [13] nanocubos, [14] nanocables, [15] y una variedad de semiconductores, [16] [17] debido a su gran susceptibilidad pero su débil fluorescencia. En particular, los nanotubos de carbono de pared simple se han estudiado ampliamente y se han obtenido imágenes con una resolución submicrométrica, [18] proporcionando detalles sobre la dinámica de los portadores y las propiedades fotofísicas y fotoquímicas. [19] [20] [21]
La primera aplicación de la técnica de bombeo-sonda en biología fue la obtención de imágenes in vitro de la emisión estimulada de una célula marcada con un colorante. [22] La obtención de imágenes de bombeo-sonda se utiliza ahora ampliamente para la obtención de imágenes de melanina para diferenciar entre las dos formas principales de melanina: eumelanina (marrón/negra) y feomelanina (roja/amarilla). [23] En el melanoma, la eumelanina aumenta sustancialmente. Por lo tanto, la obtención de imágenes de la distribución de eumelanina y feomelanina puede ayudar a distinguir las lesiones benignas y el melanoma con alta sensibilidad [24].
Las obras de arte están compuestas por numerosos pigmentos con una amplia gama de propiedades de absorción espectral, que determinan su color. Debido a las amplias características espectrales de estos pigmentos, la identificación de un pigmento específico en una mezcla es difícil. La obtención de imágenes mediante bombeo-sonda puede proporcionar información molecular precisa y de alta resolución [25] y distinguir entre pigmentos que pueden incluso tener el mismo color visual. [26]