El nucleótido aminoalilo es un nucleótido con una base modificada que contiene una alilamina . Se utilizan en el post-marcaje de ácidos nucleicos mediante detección de fluorescencia en microarrays . Son reactivos con el grupo éster de N-hidroxisuccinimida que ayuda a unir un tinte fluorescente al grupo amino primario en el nucleótido. Estos nucleótidos se conocen como 5-(3-amino alil )-nucleótidos ya que el grupo aminoalilo suele estar unido al carbono 5 del anillo de pirimidina del uracilo o la citosina . El grupo amino primario en la fracción aminoalilo es alifático y, por lo tanto, más reactivo en comparación con los grupos amino que están directamente unidos a los anillos ( aromáticos ) de las bases. Los nombres comunes de los nucleósidos aminoalílicos se abrevian inicialmente con aa- o AA- para indicar aminoalilo. El azúcar de 5 carbonos se indica con o sin la "d" minúscula que indica desoxirribosa si está incluida o ribosa si no. Finalmente se indica la base nitrogenada y el número de fosfatos (es decir, aa-UTP = aminoalil uridina trifosfato ).
El objetivo de combinar la fluorescencia y los ácidos nucleicos ha sido proporcionar una etiqueta no isotópica que sea detectable para estudiar el ADN o el ARN . Este tipo de etiquetado permite a los científicos estudiar el ADN o el ARN en su estructura, función o formación con otros ácidos nucleicos. [2] La primera modificación de bases para el etiquetado fluorescente ocurrió en 1971 con una 4-tiouridina y un 4-tiouracilo. [3] Esta investigación junto con otras, que incluyeron varios tipos de etiquetado directo y no directo a través de análogos , adición a través de enzimas u otros métodos, hicieron que el etiquetado de nucleótidos fuera mucho más seguro para los científicos para estudiar el ADN. [2]
A medida que la instrumentación y las tecnologías se vuelven más avanzadas en el campo de la micromatriz de ADN , se necesitarán mejores reactivos y técnicas para avanzar en los estudios científicos. Se demostró que el marcado fluorescente con Cy3 era más insuficiente y distorsionaba los resultados; en su lugar, se optó por el método de incorporación de nucleótidos aminoalílicos. El uso de nucleótidos aminoalílicos como marcado fluorescente indirecto pareció anular los problemas de sensibilidad observados en el marcado con cianina . [4]
Los nucleósidos aminoalílicos se pueden sintetizar mediante acoplamiento de Heck como se muestra en la imagen a continuación. [5]
En la imagen de arriba, a la izquierda, se encuentra un nucleósido modificado con un yodo (el yodo se agrega mediante halogenación electrofílica ) en el quinto carbono del anillo de pirimidina. Su formación se puede asociar con una reacción con una alilamina y varios reactivos mediante acoplamiento de heck pueden eliminar el grupo halógeno de la base y agregar la alilamina para convertirse en el nucleósido aminoalílico que se muestra a la derecha. [5] El producto de la derecha se utiliza luego en biología molecular en la síntesis de ARN. [4] [6] [7]
Otras reacciones incluyen el uso de síntesis en un solo recipiente con otros halógenos . [8]
La amina primaria del nucleótido aminoalilo reacciona con colorantes amino-reactivos [9] como la cianina y colorantes patentados [10] [11] que contienen un grupo saliente reactivo, como un éster succinimidílico ( NHS ). Los grupos amino directamente unidos al anillo de la base no se ven afectados. Estos nucleótidos se utilizan para etiquetar el ADN. [4] [6] [10] [11] [12]
Los NTP aminoalílicos se utilizan para el etiquetado indirecto de ADN en PCR , traducción de mellas , extensiones de cebadores y síntesis de ADNc . [13] Estos NTP marcados son útiles debido a su aplicación en laboratorios de biología molecular donde no tienen la capacidad de manejar material radiactivo. Por ejemplo, los 5-(3-aminoalil)-uridina (AA-UTP) son más eficaces para el etiquetado de alta densidad de ADN que el preetiquetado del ADN. Después de la adición enzimática de los NTP, se pueden agregar colorantes fluorescentes reactivos de amina para la detección de la molécula de ADN. [7] Cuando se incorpora a moléculas de ADN o ARN por la ADN/ARN polimerasa , los 5-(3-aminoalil)-UTP proporcionan un grupo reactivo para la adición de otros grupos químicos. Por lo tanto, el ADN o ARN modificado con aminoalilo se puede marcar con cualquier compuesto que tenga un grupo reactivo a la amina. Los aa-NTP incorporados al ADN/ARN en combinación con reactivos de acoplamiento de colorante secundario pueden ser una sonda para un análisis de matriz. [6]
El ADNc se basa en el marcaje con aminoalilo para fines de detección. Aunque el marcaje directo de dNTP es el método más rápido y económico de marcaje fluorescente, es desventajoso ya que la secuencia solo permite el uso de un nucleótido modificado. Otra desventaja del marcaje directo es el volumen de los nucleótidos, sin embargo, esto se puede superar con el marcaje indirecto utilizando nucleótidos modificados con aminoalilo. [14] Una forma sencilla de comprobar el éxito del marcaje es el color; un buen marcaje dará como resultado un color azul (Cy5) o rojo (Cy3) visible en el material final. [15]
Otro proceso que utiliza el marcaje con aminoalilo es la NASBA (Amplificación Basada en la Secuencia de Ácidos Nucleicos), una técnica de alta sensibilidad para amplificar el ARN. En este caso específico, los ARN modificados con aaUTP se marcaron con el marcador fluorescente Cy3. La NASBA combinada con el marcaje con aminoalilo-UTP es muy útil para muchas áreas diferentes del diagnóstico microbiano, incluyendo el monitoreo ambiental , la detección de amenazas biológicas, el monitoreo de procesos industriales y la microbiología clínica. [16] La micromatriz de ADN es otro método que utiliza específicamente AA-NTP, lo que hace que las pruebas de micromatriz de ADN sean más rápidas y económicas. [12]
El etiquetado posterior a la síntesis evita los problemas encontrados en la incorporación enzimática directa de dNTP marcados con Cy mediante la generación de sondas con la misma eficacia de etiquetado. Con el etiquetado indirecto, los NTP modificados con amina se incorporan durante la transcripción inversa , la amplificación de ARN o la PCR . Los aminoalil-NTP se incorporan con una eficacia similar a la de los NTP no modificados durante la polimerización. [17] [18]
Preocupaciones con el etiquetado: El grupo amino, en el nucleótido modificado con aminoalilo, es reactivo con colorantes como la serie de cianina u otros colorantes patentados. Surge un problema cuando los colorantes reaccionan con agentes tampón que son necesarios para el almacenamiento adecuado de los nucleótidos. Sin embargo, se puede utilizar un tampón de carbonato para superar este problema. [19]