El cribado de alto rendimiento ( HTS ) es un método de descubrimiento científico especialmente utilizado en el descubrimiento de fármacos y relevante para los campos de la biología , la ciencia de los materiales [1] y la química . [2] [3] Mediante el uso de robótica , software de procesamiento/control de datos, dispositivos de manipulación de líquidos y detectores sensibles, el cribado de alto rendimiento permite a un investigador realizar rápidamente millones de pruebas químicas, genéticas o farmacológicas. A través de este proceso, se pueden reconocer rápidamente compuestos activos, anticuerpos o genes que modulan una vía biomolecular particular. Los resultados de estos experimentos proporcionan puntos de partida para el diseño de fármacos y para comprender la no interacción o el papel de una ubicación particular.
El material de laboratorio o recipiente de prueba clave de HTS es la microplaca , que es un recipiente pequeño, generalmente desechable y hecho de plástico, que presenta una cuadrícula de pequeñas hendiduras abiertas llamadas pocillos . En general, las microplacas para HTS tienen 96, 192, 384, 1536, 3456 o 6144 pocillos. Todos estos son múltiplos de 96, lo que refleja la microplaca original de 96 pocillos con pocillos espaciados de 8 x 12 con un espaciado de 9 mm. La mayoría de los pocillos contienen elementos de prueba, según la naturaleza del experimento. Estos podrían ser diferentes compuestos químicos disueltos, por ejemplo, en una solución acuosa de dimetilsulfóxido (DMSO). Los pocillos también podrían contener células o enzimas de algún tipo. (Los otros pocillos pueden estar vacíos o contener disolvente puro o muestras sin tratar, destinadas a su uso como controles experimentales ).
Un centro de detección suele contar con una biblioteca de placas de reserva , cuyo contenido está cuidadosamente catalogado, y cada una de las cuales puede haber sido creada por el laboratorio u obtenida de una fuente comercial. Estas placas de reserva en sí mismas no se utilizan directamente en experimentos; en su lugar, se crean placas de ensayo independientes según sea necesario. Una placa de ensayo es simplemente una copia de una placa de reserva, creada pipeteando una pequeña cantidad de líquido (a menudo medida en nanolitros ) de los pocillos de una placa de reserva a los pocillos correspondientes de una placa completamente vacía.
Para preparar un ensayo , el investigador llena cada pocillo de la placa con alguna entidad biológica sobre la que desea realizar el experimento, como una proteína , células o un embrión animal . Después de que haya pasado un tiempo de incubación para permitir que la materia biológica absorba, se una o reaccione (o no reaccione) con los compuestos en los pocillos, se toman mediciones en todos los pocillos de la placa, ya sea manualmente o con una máquina. Las mediciones manuales suelen ser necesarias cuando el investigador usa microscopía para (por ejemplo) buscar cambios o defectos en el desarrollo embrionario causados por los compuestos de los pocillos, buscando efectos que una computadora no podría determinar fácilmente por sí sola. De lo contrario, una máquina de análisis automatizada especializada puede ejecutar una serie de experimentos en los pocillos (como iluminarlos con luz polarizada y medir la reflectividad, que puede ser una indicación de la unión de proteínas). En este caso, la máquina genera el resultado de cada experimento como una cuadrícula de valores numéricos, y cada número se asigna al valor obtenido de un solo pocillo. Una máquina de análisis de alta capacidad puede medir docenas de placas en el espacio de unos pocos minutos como ésta, generando miles de puntos de datos experimentales muy rápidamente.
Dependiendo de los resultados de este primer ensayo, el investigador puede realizar ensayos de seguimiento dentro de la misma pantalla "seleccionando" líquido de los pocillos fuente que dieron resultados interesantes (conocidos como "hits") en nuevas placas de ensayo y luego volver a ejecutar el experimento para recopilar más datos sobre este conjunto reducido, confirmando y refinando las observaciones.
La automatización es un elemento esencial en la utilidad de los sistemas de análisis de alto rendimiento. Normalmente, un sistema robótico integrado que consta de uno o más robots transporta las microplacas de ensayo de una estación a otra para la adición de muestras y reactivos, la mezcla, la incubación y, finalmente, la lectura o detección. Un sistema de análisis de alto rendimiento normalmente puede preparar, incubar y analizar muchas placas simultáneamente, lo que acelera aún más el proceso de recolección de datos. Actualmente existen robots de análisis de alto rendimiento que pueden analizar hasta 100 000 compuestos por día. [4] [5] Los recolectores automáticos de colonias seleccionan miles de colonias microbianas para el cribado genético de alto rendimiento. [6] El término uHTS o cribado de ultraalto rendimiento se refiere (circa 2008) al cribado de más de 100 000 compuestos por día. [7]
Con la capacidad de cribado rápido de diversos compuestos (como moléculas pequeñas o siRNAs ) para identificar compuestos activos, HTS ha llevado a una explosión en la tasa de datos generados en los últimos años. [8] En consecuencia, uno de los desafíos más fundamentales en los experimentos HTS es extraer significado bioquímico de montañas de datos, lo que se basa en el desarrollo y la adopción de diseños experimentales y métodos analíticos apropiados tanto para el control de calidad como para la selección de resultados. [9] La investigación HTS es uno de los campos que tienen una característica descrita por John Blume, Director Científico de Applied Proteomics, Inc., de la siguiente manera: Pronto, si un científico no entiende algunas estadísticas o tecnologías rudimentarias de manejo de datos, puede que no sea considerado un verdadero biólogo molecular y, por lo tanto, simplemente se convertirá en "un dinosaurio". [10]
Los ensayos de alta calidad de HTS son fundamentales en los experimentos de HTS. El desarrollo de ensayos de HTS de alta calidad requiere la integración de enfoques tanto experimentales como computacionales para el control de calidad (QC). Tres medios importantes de QC son (i) un buen diseño de placa, (ii) la selección de controles químicos/biológicos positivos y negativos efectivos, y (iii) el desarrollo de métricas de QC efectivas para medir el grado de diferenciación de modo que se puedan identificar los ensayos con calidad de datos inferior. [11] Un buen diseño de placa ayuda a identificar errores sistemáticos (especialmente aquellos vinculados con la posición del pocillo) y a determinar qué normalización se debe utilizar para eliminar/reducir el impacto de los errores sistemáticos tanto en el QC como en la selección de aciertos. [9]
Los métodos analíticos de control de calidad eficaces sirven como un guardián de los ensayos de excelente calidad. En un experimento HTS típico, una distinción clara entre un control positivo y una referencia negativa, como un control negativo, es un índice de buena calidad. Se han propuesto muchas medidas de evaluación de la calidad para medir el grado de diferenciación entre un control positivo y una referencia negativa. La relación señal-fondo, la relación señal-ruido, la ventana de señal, la relación de variabilidad del ensayo y el factor Z se han adoptado para evaluar la calidad de los datos. [9] [12] Recientemente se ha propuesto la diferencia de medias estrictamente estandarizada ( SSMD ) para evaluar la calidad de los datos en los ensayos HTS. [13] [14]
Un compuesto con un tamaño deseado de efectos en un HTS se denomina éxito. El proceso de selección de éxitos se denomina selección de éxitos. Los métodos analíticos para la selección de éxitos en los análisis sin réplicas (normalmente en los análisis primarios) difieren de los que tienen réplicas (normalmente en los análisis confirmatorios). Por ejemplo, el método de puntuación z es adecuado para los análisis sin réplicas, mientras que el estadístico t es adecuado para los análisis con réplicas. El cálculo de SSMD para los análisis sin réplicas también difiere del de los análisis con réplicas. [9]
Para la selección de resultados en los análisis primarios sin réplicas, los métodos fácilmente interpretables son el cambio de pliegue promedio, la diferencia de medias, el porcentaje de inhibición y el porcentaje de actividad. Sin embargo, no capturan la variabilidad de los datos de manera efectiva. El método de puntuación z o SSMD, que puede capturar la variabilidad de los datos basándose en el supuesto de que cada compuesto tiene la misma variabilidad que una referencia negativa en los análisis. [15] [16] Sin embargo, los valores atípicos son comunes en los experimentos de HTS, y los métodos como la puntuación z son sensibles a los valores atípicos y pueden ser problemáticos. Como consecuencia, se han propuesto y adoptado métodos robustos como el método de puntuación z*, SSMD*, el método de puntuación B y el método basado en cuantiles para la selección de resultados. [5] [9] [17] [18]
En una selección con réplicas, podemos estimar directamente la variabilidad para cada compuesto; como consecuencia, deberíamos usar SSMD o estadística t que no se base en el supuesto fuerte en el que se basan la puntuación z y la puntuación z*. Un problema con el uso de la estadística t y los valores p asociados es que se ven afectados tanto por el tamaño de la muestra como por el tamaño del efecto. [19] Provienen de pruebas de no diferencia de medias y, por lo tanto, no están diseñados para medir el tamaño de los efectos de los compuestos. Para la selección de aciertos, el principal interés es el tamaño del efecto en un compuesto probado. SSMD evalúa directamente el tamaño de los efectos. [20] También se ha demostrado que SSMD es mejor que otros tamaños de efecto comúnmente utilizados. [21] El valor poblacional de SSMD es comparable entre experimentos y, por lo tanto, podemos usar el mismo punto de corte para el valor poblacional de SSMD para medir el tamaño de los efectos de los compuestos. [22]
Se pueden emplear distribuciones únicas de compuestos en una o varias placas para aumentar la cantidad de ensayos por placa o para reducir la varianza de los resultados del ensayo, o ambas cosas. La suposición simplificadora que se hace en este enfoque es que los N compuestos en el mismo pocillo normalmente no interactuarán entre sí, o con el objetivo del ensayo, de una manera que cambie fundamentalmente la capacidad del ensayo para detectar resultados verdaderos.
Por ejemplo, imaginemos una placa en la que el compuesto A se encuentra en los pocillos 1-2-3, el compuesto B en los pocillos 2-3-4 y el compuesto C en los pocillos 3-4-5. En un ensayo de esta placa contra un objetivo determinado, un resultado positivo en los pocillos 2, 3 y 4 indicaría que el compuesto B es el agente más probable, a la vez que proporcionaría tres mediciones de la eficacia del compuesto B contra el objetivo especificado. Las aplicaciones comerciales de este enfoque implican combinaciones en las que nunca dos compuestos comparten más de un pocillo, para reducir la posibilidad (de segundo orden) de interferencia entre pares de compuestos que se están analizando.
Los científicos del Centro de Genómica Química del NIH (NCGC) aprovecharon la automatización y los formatos de ensayo de bajo volumen para desarrollar HTS cuantitativo (qHTS), un paradigma para perfilar farmacológicamente grandes bibliotecas químicas mediante la generación de relaciones concentración-respuesta completas para cada compuesto. Con el ajuste de curvas y el software de quimioinformática que lo acompaña, los datos de qHTS producen la mitad de la concentración máxima efectiva (EC50), la respuesta máxima y el coeficiente de Hill (nH) para toda la biblioteca, lo que permite la evaluación de las relaciones estructura-actividad (SAR) nacientes. [23]
En marzo de 2010, se publicó una investigación que demostraba un proceso HTS que permitía un cribado 1000 veces más rápido (100 millones de reacciones en 10 horas) a un millonésimo costo (usando 10 −7 veces el volumen de reactivo) que las técnicas convencionales que utilizan microfluídica basada en gotas. [23] Las gotas de fluido separadas por aceite reemplazan los pocillos de microplacas y permiten el análisis y la clasificación de resultados mientras los reactivos fluyen a través de los canales.
En 2010, los investigadores desarrollaron una lámina de silicio de lentes que se puede colocar sobre matrices microfluídicas para permitir la medición de fluorescencia de 64 canales de salida diferentes simultáneamente con una sola cámara. [24] Este proceso puede analizar 200.000 gotas por segundo.
En 2013, los investigadores han revelado un enfoque con pequeñas moléculas de plantas. En general, es esencial proporcionar validaciones de prueba de concepto de alta calidad en las primeras etapas del proceso de descubrimiento de fármacos. En este caso, las tecnologías que permiten la identificación de sondas químicas potentes, selectivas y biodisponibles son de crucial interés, incluso si los compuestos resultantes requieren una mayor optimización para el desarrollo de un producto farmacéutico. El receptor nuclear RORα, una proteína que ha sido objeto de estudio durante más de una década para identificar agonistas potentes y biodisponibles, se utilizó como ejemplo de un objetivo farmacológico muy difícil. Los resultados se confirman en la etapa de selección debido a la curva en forma de campana. Este método es muy similar al método HTS cuantitativo (selección y confirmación de resultados al mismo tiempo), excepto que el uso de este enfoque reduce en gran medida el número de puntos de datos y puede seleccionar fácilmente más de 100.000 compuestos biológicamente relevantes. [25]
Mientras que el descubrimiento tradicional de fármacos HTS utiliza proteínas purificadas o células intactas, el desarrollo reciente de la tecnología está asociado con el uso de organismos vivos intactos, como el nematodo Caenorhabditis elegans y el pez cebra ( Danio rerio ). [26]
Entre 2016 y 2018, los fabricantes de placas comenzaron a producir productos químicos especializados para permitir la producción en masa de superficies repelentes de células con adherencia ultrabaja, lo que facilitó el rápido desarrollo de ensayos compatibles con HTS para abordar el descubrimiento de fármacos contra el cáncer en tejidos 3D como organoides y esferoides; un formato más relevante desde el punto de vista fisiológico. [27] [28] [29]
El HTS es una innovación relativamente reciente, que se hizo posible en gran medida gracias a los avances modernos en robótica y tecnología informática de alta velocidad. Aún se necesita un laboratorio de detección altamente especializado y costoso para llevar a cabo una operación de HTS, por lo que en muchos casos una institución de investigación de tamaño pequeño a mediano utilizará los servicios de una instalación de HTS existente en lugar de establecer una propia.
Existe una tendencia en el mundo académico a que las universidades sean su propia empresa de descubrimiento de fármacos. [30] Estas instalaciones, que normalmente solo se encuentran en la industria, ahora se encuentran cada vez más también en las universidades. UCLA , por ejemplo, cuenta con un laboratorio HTS de acceso abierto Molecular Screening Shared Resources (MSSR, UCLA), que puede examinar más de 100.000 compuestos al día de forma rutinaria. La política de acceso abierto garantiza que los investigadores de todo el mundo puedan aprovechar esta instalación sin largas negociaciones de propiedad intelectual. Con una biblioteca de compuestos de más de 200.000 moléculas pequeñas, el MSSR tiene una de las mayores bases de compuestos de todas las universidades de la costa oeste. Además, el MSSR cuenta con capacidades de genómica funcional completas (siRNA de todo el genoma, shRNA, cDNA y CRISPR) que son complementarias a los esfuerzos de moléculas pequeñas: La genómica funcional aprovecha las capacidades de HTS para ejecutar exámenes de todo el genoma que examinan la función de cada gen en el contexto de interés, ya sea eliminando cada gen o sobreexpresándolo. El acceso paralelo a un cribado de alto rendimiento de moléculas pequeñas y a un cribado de todo el genoma permite a los investigadores identificar y validar objetivos para una enfermedad determinada o determinar el modo de acción de una molécula pequeña. Los resultados más precisos se pueden obtener mediante el uso de bibliotecas genómicas funcionales "agrupadas", es decir, cada biblioteca contiene un único constructo, como un único ARNi o ADNc. La genómica funcional suele combinarse con un cribado de alto contenido mediante, por ejemplo, microscopía epifluorescente o citometría de barrido láser.
La Universidad de Illinois también cuenta con una instalación para HTS, al igual que la Universidad de Minnesota. El Instituto de Ciencias de la Vida de la Universidad de Michigan alberga la instalación de HTS en el Centro de Genómica Química. La Universidad de Columbia tiene una instalación de recursos compartidos de HTS con ~300.000 moléculas pequeñas diversas y ~10.000 compuestos bioactivos conocidos disponibles para el cribado bioquímico, celular y basado en NGS. La Universidad Rockefeller tiene un Centro de recursos de HTS de acceso abierto HTSRC (The Rockefeller University, HTSRC), que ofrece una biblioteca de más de 380.000 compuestos. El Laboratorio de análisis de alto rendimiento de la Universidad Northwestern respalda la identificación de objetivos, la validación, el desarrollo de ensayos y el cribado de compuestos. El Instituto de Descubrimiento Médico Sanford Burnham Prebys, una organización sin fines de lucro, también tiene una instalación de HTS de larga data en el Centro Conrad Prebys de Genómica Química, que formaba parte del MLPCN. El Centro de Detección Molecular de Scripps Research (SRMSC) [31] , una organización sin fines de lucro, continúa prestando servicios a la academia en todos los institutos posteriores a la era de la MLPCN. La instalación de la uHTS del SRMSC mantiene una de las colecciones de bibliotecas más grandes del ámbito académico, que actualmente cuenta con más de 665 000 entidades de moléculas pequeñas, y examina de manera rutinaria la colección completa o las subbibliotecas en apoyo de las iniciativas de subvenciones de múltiples investigadores principales.
En los Estados Unidos, los Institutos Nacionales de Salud (NIH) han creado un consorcio nacional de centros de detección de moléculas pequeñas para producir herramientas químicas innovadoras para su uso en la investigación biológica. La Red de Centros de Producción de Sondas de Bibliotecas Moleculares (MLPCN, por sus siglas en inglés) realiza pruebas de transferencia de moléculas en ensayos proporcionados por la comunidad de investigación, en comparación con una gran biblioteca de moléculas pequeñas mantenida en un repositorio de moléculas central.