ERCC4 es una proteína denominada endonucleasa reparadora de ADN XPF que en los seres humanos está codificada por el gen ERCC4 . Junto con ERCC1 , ERCC4 forma el complejo enzimático ERCC1-XPF que participa en la reparación y recombinación del ADN . [5] [6]
La enzima nucleasa ERCC1-XPF corta estructuras específicas del ADN. Muchos aspectos de estos dos productos génicos se describen juntos aquí porque son socios durante la reparación del ADN. La nucleasa ERCC1-XPF es una actividad esencial en la vía de reparación por escisión de nucleótidos del ADN (NER). La nucleasa ERCC1-XPF también funciona en vías para reparar roturas de doble cadena en el ADN y en la reparación de daños por "enlace cruzado" que unen de manera dañina las dos cadenas de ADN.
Las células con mutaciones incapacitantes en ERCC4 son más sensibles de lo normal a agentes específicos que dañan el ADN, incluyendo la radiación ultravioleta y a los productos químicos que causan la reticulación entre las cadenas de ADN. Los ratones modificados genéticamente con mutaciones incapacitantes en ERCC4 también tienen defectos en la reparación del ADN, acompañados de cambios inducidos por estrés metabólico en la fisiología que resultan en envejecimiento prematuro. [7] La eliminación completa de ERCC4 es incompatible con la viabilidad de los ratones, y no se han encontrado individuos humanos con eliminación completa (homocigótica) de ERCC4 . Individuos raros en la población humana albergan mutaciones hereditarias que deterioran la función de ERCC4 . Cuando los genes normales están ausentes, estas mutaciones pueden conducir a síndromes humanos, incluyendo xeroderma pigmentosum , síndrome de Cockayne y anemia de Fanconi .
ERCC1 y ERCC4 son los nombres de los genes humanos y Ercc1 y Ercc4 son los nombres de los genes análogos de los mamíferos. Se encuentran genes similares con funciones similares en todos los organismos eucariotas.
El gen humano ERCC4 puede corregir el defecto de reparación del ADN en líneas celulares mutantes específicas sensibles a la luz ultravioleta (UV) derivadas de células de ovario de hámster chino. [8] Se han aislado múltiples grupos de complementación independientes de células de ovario de hámster chino (CHO), [9] y este gen restauró la resistencia a la radiación UV en las células del grupo de complementación 4. Como reflejo de este método de complementación genética entre especies, el gen se denominó "reparación por escisión de complementación cruzada 4" [10].
El gen humano ERCC4 codifica la proteína XPF de 916 aminoácidos con una masa molecular de aproximadamente 104.000 daltons.
Se encuentran genes similares a ERCC4 con funciones equivalentes (ortólogos) en otros genomas eucariotas. Algunos de los ortólogos génicos más estudiados incluyen RAD1 en la levadura de gemación Saccharomyces cerevisiae y rad16+ en la levadura de fisión Schizosaccharomyces pombe .
Una molécula de ERCC1 y una molécula de XPF se unen entre sí, formando un heterodímero ERCC1-XPF, que es la forma nucleasa activa de la enzima. En el heterodímero ERCC1–XPF, ERCC1 media las interacciones entre el ADN y las proteínas. XPF proporciona el sitio activo de la endonucleasa y está involucrado en la unión del ADN y en otras interacciones entre proteínas. [8]
La proteína ERCC4/XPF consta de dos áreas conservadas separadas por una región menos conservada en el medio. El área N-terminal tiene homología con varios dominios conservados de helicasas de ADN pertenecientes a la superfamilia II, aunque XPF no es una helicasa de ADN. [11] La región C-terminal de XPF incluye los residuos del sitio activo para la actividad de la nucleasa. [12] (Figura 1) .
La mayor parte de la proteína ERCC1 está relacionada a nivel de secuencia con el extremo C de la proteína XPF, [13] pero no hay residuos en el dominio de la nucleasa. Un dominio de unión al ADN en forma de "hélice-horquilla-hélice" en el extremo C de cada proteína.
Por su similitud estructural y de secuencia primaria, la nucleasa ERCC1-XPF es miembro de una familia más amplia de nucleasas de ADN de estructura específica que comprenden dos subunidades. Entre estas nucleasas se encuentra, por ejemplo, la nucleasa MUS81-EME1.
El complejo ERCC1–XPF es una endonucleasa de estructura específica. ERCC1-XPF no corta ADN que sea exclusivamente monocatenario o bicatenario, sino que corta la cadena principal de fosfodiéster del ADN específicamente en las uniones entre el ADN bicatenario y el monocatenario. Introduce un corte en el ADN bicatenario en el lado 5′ de dicha unión, a unos dos nucleótidos de distancia [14] (Figura 2) . Esta especificidad de estructura se demostró inicialmente para RAD10-RAD1, los ortólogos de levadura de ERCC1 y XPF. [15]
Los motivos hidrofóbicos de hélice-horquilla-hélice en las regiones C-terminales de ERCC1 y XPF interactúan para promover la dimerización de las dos proteínas. [16] [17] No hay actividad catalítica en ausencia de dimerización. De hecho, aunque el dominio catalítico está dentro de XPF y ERCC1 es catalíticamente inactivo, ERCC1 es indispensable para la actividad del complejo.
Se han propuesto varios modelos para la unión de ERCC1–XPF al ADN, basados en estructuras parciales de fragmentos de proteínas relevantes con resolución atómica. [16] La unión al ADN mediada por los dominios hélice-horquilla-hélice de los dominios ERCC1 y XPF posiciona al heterodímero en la unión entre el ADN bicatenario y el ADN monocatenario.
Durante la reparación por escisión de nucleótidos, varios complejos proteicos cooperan para reconocer el ADN dañado y separar localmente la hélice de ADN por una corta distancia a cada lado del sitio de un daño en el ADN. La nucleasa ERCC1–XPF corta la cadena de ADN dañada en el lado 5′ de la lesión. [14] Durante la NER, la proteína ERCC1 interactúa con la proteína XPA para coordinar la unión del ADN y la proteína.
Las células de mamíferos con ERCC1–XPF mutante son moderadamente más sensibles que las células normales a los agentes (como la radiación ionizante) que causan roturas de doble cadena en el ADN. [18] [19] Las vías particulares de reparación de recombinación homóloga y unión de extremos no homólogos dependen de la función de ERCC1-XPF. [20] [21] La actividad relevante de ERCC1–XPF para ambos tipos de reparación de rotura de doble cadena es la capacidad de eliminar las colas monocatenarias 3′ no homólogas de los extremos del ADN antes de volver a unirlas. Esta actividad es necesaria durante una subvía de recocido monocatenario de recombinación homóloga. El recorte de las colas monocatenarias 3' también es necesario en una subvía mecanísticamente distinta de unión de extremos no homólogos, independiente de las proteínas Ku [22] [19] La integración homóloga del ADN, una técnica importante para la manipulación genética, depende de la función de ERCC1-XPF en la célula huésped. [23]
Las células de mamíferos que portan mutaciones en ERCC1 o XPF son especialmente sensibles a los agentes que causan enlaces cruzados entre cadenas de ADN (ICL) [24]. Los enlaces cruzados entre cadenas bloquean la progresión de la replicación de ADN, y las estructuras en las horquillas de replicación de ADN bloqueadas proporcionan sustratos para la escisión por ERCC1-XPF. [20] [25] Se pueden hacer incisiones en ambos lados del enlace cruzado en una cadena de ADN para desenganchar el enlace cruzado e iniciar la reparación. Alternativamente, se puede hacer una rotura de doble cadena en el ADN cerca del ICL, y la reparación posterior por recombinación homóloga puede involucrar la acción de ERCC1-XPF. Aunque no es la única nucleasa involucrada, ERCC1–XPF es necesaria para la reparación del ICL durante varias fases del ciclo celular. [26] [27]
Algunas personas con el síndrome hereditario poco frecuente xeroderma pigmentoso tienen mutaciones en ERCC4. Estos pacientes se clasifican como grupo de complementación XP F (XP-F). Las características diagnósticas del XP son piel seca y escamosa, pigmentación anormal de la piel en áreas expuestas al sol y fotosensibilidad grave, acompañadas de un riesgo 1000 veces mayor de desarrollar cánceres de piel inducidos por la radiación UV. [5]
La mayoría de los pacientes con XP-F presentan síntomas moderados de XP, pero algunos presentan síntomas adicionales del síndrome de Cockayne. [28] Los pacientes con síndrome de Cockayne (SC) presentan fotosensibilidad y también presentan defectos del desarrollo y síntomas neurológicos. [5] [7]
Las mutaciones en el gen ERCC4 pueden provocar el muy raro síndrome XF-E. [29] Estos pacientes tienen características de XP y CS, así como síntomas neurológicos, hepatobiliares, musculoesqueléticos y hematopoyéticos adicionales.
Varios pacientes humanos con síntomas de anemia de Fanconi (AF) tienen mutaciones causales en el gen ERCC4. La anemia de Fanconi es una enfermedad compleja, que implica síntomas hematopoyéticos importantes. Un rasgo característico de la AF es la hipersensibilidad a los agentes que causan enlaces cruzados entre cadenas de ADN. Los pacientes con AF con mutaciones de ERCC4 han sido clasificados como pertenecientes al grupo de complementación de anemia de Fanconi Q (FANCQ). [28] [30]
El ERCC4 (XPF) se expresa normalmente en un nivel alto en los núcleos celulares dentro de la superficie interna del colon (ver imagen, panel C). La superficie interna del colon está revestida con epitelio columnar simple con invaginaciones . Las invaginaciones se denominan glándulas intestinales o criptas del colon. Las criptas del colon tienen forma de tubos de ensayo microscópicos de paredes gruesas con un orificio central a lo largo del tubo (el lumen de la cripta ). Las criptas tienen una longitud de aproximadamente 75 a 110 células. La reparación del ADN, que implica una alta expresión de las proteínas ERCC4 (XPF), PMS2 y ERCC1, parece ser muy activa en las criptas del colon en el epitelio del colon normal, no neoplásico .
Las células se producen en la base de la cripta y migran hacia arriba a lo largo del eje de la cripta antes de desprenderse al lumen colónico días después. [32] Hay de 5 a 6 células madre en las bases de las criptas. [32] Hay alrededor de 10 millones de criptas a lo largo de la superficie interna del colon humano promedio . [31] Si las células madre en la base de la cripta expresan ERCC4 (XPF), generalmente todos los miles de células de la cripta también expresarán ERCC4 (XPF). Esto se indica por el color marrón visto por inmunotinción de ERCC4 (XPF) en casi todas las células de la cripta en el panel C de la imagen en esta sección. Una expresión similar de PMS2 y ERCC1 ocurre en los miles de células en cada cripta colónica normal.
La sección de tejido en la imagen que se muestra aquí también fue contrateñida con hematoxilina para teñir el ADN en los núcleos de un color gris azulado. Los núcleos de las células en la lámina propia , células que están debajo y rodean las criptas epiteliales, muestran en gran parte el color gris azulado de la hematoxilina y tienen poca expresión de PMS2, ERCC1 o ERCC4 (XPF). Además, las células en las partes superiores de las criptas teñidas para PMS2 (panel A) o ERCC4 (XPF) (panel C) tienen niveles bajos de estas proteínas reparadoras del ADN, de modo que dichas células también muestran la tinción gris azulada del ADN. [31]
ERCC4 (XPF) es deficiente en aproximadamente el 55% de los cánceres de colon, y en aproximadamente el 40% de las criptas del colon en el epitelio dentro de los 10 cm adyacentes a los cánceres (en los defectos de campo de los cuales probablemente surgieron los cánceres). [31] Cuando ERCC4 (XPF) está reducido en las criptas colónicas en un defecto de campo, se asocia con mayor frecuencia con una expresión reducida de las enzimas de reparación del ADN ERCC1 y PMS2 también, como se ilustra en la imagen de esta sección. Las deficiencias en ERCC1 (XPF) en el epitelio del colon parecen deberse a la represión epigenética . [31] Una deficiencia de ERCC4 (XPF) conduciría a una reparación reducida de los daños del ADN. Como lo indican Harper y Elledge, [33] los defectos en la capacidad de responder adecuadamente y reparar el daño del ADN subyacen a muchas formas de cáncer. La frecuente reducción epigenética en ERCC4 (XPF) en los defectos de campo que rodean los cánceres de colon, así como en los cánceres (junto con las reducciones epigenéticas en ERCC1 y PMS2) indican que dichas reducciones a menudo pueden desempeñar un papel central en la progresión al cáncer de colon.
Aunque las reducciones epigenéticas en la expresión de ERCC4 (XPF) son frecuentes en los cánceres de colon humanos, las mutaciones en ERCC4 (XPF) son raras en humanos. [34] Sin embargo, una mutación en ERCC4 (XPF) hace que los pacientes sean propensos al cáncer de piel. [34] Un polimorfismo heredado en ERCC4 (XPF) también parece ser importante en el cáncer de mama. [35] Estas alteraciones mutacionales poco frecuentes subrayan el papel probable de la deficiencia de ERCC4 (XPF) en la progresión al cáncer.