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Reacción en cadena de la polimerasa digital

La reacción en cadena de la polimerasa digital ( PCR digital , DigitalPCR , dPCR o dePCR ) es un refinamiento biotecnológico de los métodos convencionales de reacción en cadena de la polimerasa que se pueden utilizar para cuantificar directamente y amplificar clonalmente cadenas de ácidos nucleicos, incluyendo ADN , ADNc o ARN . La diferencia clave entre dPCR y qPCR radica en el método de medición de las cantidades de ácidos nucleicos, siendo el primero un método más preciso que la PCR, aunque también más propenso a errores en manos de usuarios inexpertos. [1] La PCR lleva a cabo una reacción por cada muestra individual. La dPCR también lleva a cabo una única reacción dentro de una muestra, sin embargo, la muestra se separa en un gran número de particiones y la reacción se lleva a cabo en cada partición individualmente. Esta separación permite una recolección más confiable y una medición sensible de las cantidades de ácidos nucleicos. Se ha demostrado que el método es útil para estudiar variaciones en secuencias genéticas, como variantes del número de copias y mutaciones puntuales.

Principios

El método de reacción en cadena de la polimerasa se utiliza para cuantificar los ácidos nucleicos mediante la amplificación de una molécula de ácido nucleico con la enzima ADN polimerasa . [2] La PCR convencional se basa en la teoría de que la amplificación es exponencial. Por lo tanto, los ácidos nucleicos se pueden cuantificar comparando el número de ciclos de amplificación y la cantidad de producto final de la PCR con los de una muestra de referencia. [3] Sin embargo, muchos factores complican este cálculo, creando incertidumbres e imprecisiones. Estos factores incluyen los siguientes: los ciclos de amplificación iniciales pueden no ser exponenciales; la amplificación por PCR finalmente se estabiliza después de un número incierto de ciclos; y las bajas concentraciones iniciales de moléculas de ácido nucleico diana pueden no amplificarse a niveles detectables. Sin embargo, la limitación más significativa de la PCR es que la eficiencia de la amplificación por PCR en una muestra de interés puede ser diferente a la de las muestras de referencia.

Figura 1. Gotas de aceite que contienen la molécula diana de PCR fluorescente
Figura 2. La fracción de gotas positivas predice el número de copias objetivo por gota modeladas por la distribución de Poisson

En lugar de realizar una reacción por pocillo, la dPCR implica dividir la solución de PCR en decenas de miles de gotitas de tamaño nanométrico, donde tiene lugar una reacción de PCR separada en cada una. [4] [5] Una solución de PCR se elabora de forma similar a un ensayo TaqMan , que consta de ADN (o ARN) molde, sondas inhibidoras de fluorescencia, cebadores y una mezcla maestra de PCR , que contiene ADN polimerasa , dNTP , MgCl2 y tampones de reacción en concentraciones óptimas. Se pueden utilizar varios métodos diferentes para dividir las muestras, incluidas las microplacas, los capilares, la emulsión de aceite y las matrices de cámaras miniaturizadas con superficies de unión de ácidos nucleicos. [6] La solución de PCR se divide en unidades más pequeñas, cada una con los componentes necesarios para la amplificación. Las unidades divididas se someten luego a un termociclado para que cada unidad pueda experimentar de forma independiente la amplificación por PCR. Después de varios ciclos de amplificación por PCR, se comprueba la fluorescencia de las muestras con una lectura binaria de "0" o "1". Se registra la fracción de gotitas fluorescentes. [5] La partición de la muestra permite estimar el número de moléculas diferentes asumiendo que la población de moléculas sigue la distribución de Poisson , lo que explica la posibilidad de que múltiples moléculas objetivo habiten una sola gota. Usando la ley de Poisson de números pequeños, la distribución de la molécula objetivo dentro de la muestra se puede aproximar con precisión, lo que permite una cuantificación de la cadena objetivo en el producto de PCR. [7] Este modelo simplemente predice que a medida que aumenta el número de muestras que contienen al menos una molécula objetivo, aumenta la probabilidad de que las muestras contengan más de una molécula objetivo. [8] En la PCR convencional, el número de ciclos de amplificación por PCR es proporcional al número de copias inicial. A diferencia de la creencia de muchas personas de que la dPCR proporciona una cuantificación absoluta, la PCR digital utiliza el poder estadístico para proporcionar una cuantificación relativa. Por ejemplo, si la Muestra A, cuando se analiza en 1 millón de particiones, da una reacción positiva, no significa que la Muestra A tenga una molécula inicial. [ cita requerida ]

Los beneficios de la dPCR incluyen una mayor precisión a través de la partición masiva de muestras, lo que garantiza mediciones confiables en la secuencia de ADN deseada debido a la reproducibilidad. [5] Las tasas de error son mayores cuando se detectan diferencias de cambio de pequeño pliegue con PCR básica, mientras que las tasas de error son menores con dPCR debido a las diferencias de cambio de menor pliegue que se pueden detectar en la secuencia de ADN. La técnica en sí reduce el uso de un mayor volumen de reactivo necesario, lo que inevitablemente reducirá el costo del experimento. Además, la dPCR es altamente cuantitativa ya que no depende de la fluorescencia relativa de la solución para determinar la cantidad de ADN diana amplificado.

Comparación entre dPCR y PCR en tiempo real (qPCR)

La dPCR mide la cantidad real de moléculas (ADN diana) que hay en cada gota, lo que la convierte en una medición “digital” discreta. Proporciona una cuantificación absoluta porque la dPCR mide la fracción positiva de las muestras, que es la cantidad de gotas que emiten fluorescencia debido a una amplificación adecuada. Esta fracción positiva indica con precisión la cantidad inicial de ácido nucleico molde. De manera similar, la qPCR utiliza fluorescencia; sin embargo, mide la intensidad de la fluorescencia en momentos específicos (generalmente después de cada ciclo de amplificación) para determinar la cantidad relativa de molécula diana (ADN), pero no puede especificar la cantidad exacta sin construir una curva estándar utilizando diferentes cantidades de un estándar definido. Proporciona el umbral por ciclo (CT) y la diferencia en CT se utiliza para calcular la cantidad de ácido nucleico inicial. Como tal, la qPCR es una medición analógica, que puede no ser tan precisa debido a la extrapolación necesaria para obtener una medición. [6] [9]

La dPCR mide la cantidad de ADN una vez finalizada la amplificación y luego determina la fracción de réplicas. Esto es representativo de una medición de punto final, ya que requiere la observación de los datos una vez finalizado el experimento. Por el contrario, la qPCR registra la fluorescencia relativa del ADN en puntos específicos durante el proceso de amplificación, lo que requiere paradas en el proceso experimental. Este aspecto de "tiempo real" de la qPCR puede afectar teóricamente los resultados debido a la detención del experimento. [ cita requerida ] En la práctica, sin embargo, la mayoría de los termocicladores de qPCR leen la fluorescencia de cada muestra muy rápidamente al final del paso de hibridación/extensión antes de proceder al siguiente paso de fusión, lo que significa que esta preocupación hipotética no es realmente relevante o aplicable para la gran mayoría de los investigadores. La dPCR mide la amplificación midiendo los productos del ciclo de PCR de punto final y, por lo tanto, es menos susceptible a los artefactos que surgen de eficiencias de amplificación deterioradas debido a la presencia de inhibidores de PCR o desajustes de la plantilla de cebadores. [10] [11]

La PCR digital en tiempo real (rdPCR) combina las metodologías de la PCR digital (dPCR) y la PCR cuantitativa (qPCR), integrando la precisión de la dPCR con las capacidades de análisis en tiempo real de la qPCR. Esta integración tiene como objetivo proporcionar una mayor sensibilidad, especificidad y capacidad de cuantificación absoluta de las secuencias de ácidos nucleicos, contribuyendo a la cuantificación del material genético en la investigación científica y clínica. [12] [13]

La qPCR no puede distinguir diferencias en la expresión génica o variaciones en el número de copias que sean menores que el doble. Por otro lado, la dPCR tiene una mayor precisión y se ha demostrado que detecta diferencias de menos del 30% en la expresión génica, distingue entre variaciones en el número de copias que difieren en solo 1 copia e identifica alelos que ocurren en frecuencias menores al 0,1%. [14] [5]

Aplicaciones

La PCR digital tiene muchas aplicaciones en la investigación básica , el diagnóstico clínico y las pruebas ambientales. Sus usos incluyen la detección de patógenos y el análisis de la salud digestiva ; [15] [16] biopsia líquida para el seguimiento del cáncer , el seguimiento del rechazo de trasplantes de órganos y las pruebas prenatales no invasivas para detectar anomalías genéticas graves ; [17] [18] [19] [20 ] [21] [22] [23] [24] análisis de la variación del número de copias , [25] [26] [27] análisis de la expresión de un solo gen, [28] detección de secuencias raras, [24] [29] [30] perfil de expresión génica y análisis de células individuales ; [31] [32] [30] [33] [34] [35] [36] la detección de contaminantes del ADN en el bioprocesamiento, [37] la validación de ediciones genéticas y la detección de cambios específicos de metilación en el ADN como biomarcadores del cáncer , [38] [39] [40] así como la determinación del número de copias de plásmidos en poblaciones bacterianas. [41] La dPCR también se utiliza con frecuencia como método ortogonal para confirmar mutaciones raras detectadas a través de la secuenciación de próxima generación (NGS) y para validar bibliotecas NGS . [42] [43] [44]

Cuantificación absoluta

La dPCR permite la cuantificación absoluta y reproducible de ácidos nucleicos diana con una resolución de molécula única. [30] [45] [46] [47] Sin embargo, a diferencia de la PCR cuantitativa analógica (qPCR), la cuantificación absoluta con dPCR no requiere una curva estándar . [45] La dPCR también tiene una mayor tolerancia a las sustancias inhibidoras y los ensayos de PCR que amplifican de manera ineficiente en comparación con la qPCR. [48] [11]

La dPCR puede cuantificar, por ejemplo, la presencia de secuencias específicas de organismos modificados genéticamente contaminantes en alimentos, [49] la carga viral en la sangre, [50] PBMC , [51] [52] muestras de suero, [53] tejidos de vellosidades coriónicas, [51] [52] biomarcadores de enfermedades neurodegenerativas en el líquido cefalorraquídeo, [54] y contaminación fecal en el agua potable. [55]

Variación del número de copias

Una alteración en el estado del número de copias con respecto a un locus de referencia de copia única se conoce como una " variación del número de copias " (CNV) si aparece en células de la línea germinal, o una alteración del número de copias (CNA) si aparece en células somáticas. [56] Una CNV o CNA podría deberse a una deleción o amplificación de un locus con respecto al número de copias del locus de referencia presente en la célula, y juntos, son contribuyentes principales a la variabilidad en el genoma humano . [57] [58] [59] Se han asociado con cánceres; [60] [61] [62] enfermedades neurológicas, [63] psiquiátricas, [64] [65] y autoinmunes; [66] y reacciones adversas a medicamentos. [67] Sin embargo, es difícil medir estas variaciones alélicas con alta precisión utilizando otros métodos como qPCR, lo que dificulta las asociaciones fenotípicas y de enfermedades con el estado alterado de CNV. [68] [69]

La gran cantidad de mediciones de puntos finales “digitalizadas” que se hacen posibles gracias a la partición de muestras permite que la dPCR resuelva pequeñas diferencias en el número de copias con mayor precisión y exactitud en comparación con otros métodos, como los microarreglos basados ​​en SNP [70] o la qPCR. [71] [72] La qPCR tiene una capacidad limitada para cuantificar con precisión las amplificaciones genéticas en varias enfermedades, incluidas la enfermedad de Crohn, la infección por VIH-1 y la obesidad. [73] [69] [72]

La dPCR fue diseñada para medir la concentración de un ácido nucleico diana en copias por unidad de volumen de la muestra. Cuando se trabaja en reacciones diluidas donde menos del ~10% de las particiones contienen un objetivo deseado (denominadas "dilución limitante"), el número de copias se puede estimar comparando el número de gotitas fluorescentes que surgen de un CNV objetivo con el número de gotitas fluorescentes que surgen de un locus de referencia de copia única invariante. [25] De hecho, tanto en estas concentraciones de objetivo más bajas como en las más altas donde múltiples copias del mismo objetivo pueden co-localizarse en una sola partición, se utilizan las estadísticas de Poisson para corregir estas ocupaciones múltiples y dar un valor más preciso para la concentración de cada objetivo. [74] [6]

La PCR digital se ha utilizado para descubrir variaciones tanto de la línea germinal como somáticas en el número de copias de genes entre humanos [75] y para estudiar el vínculo entre la amplificación de HER2 (ERBB2) y la progresión del cáncer de mama . [76] [77] [78] [27]

Detección de mutaciones raras y alelos raros

La partición en PCR digital aumenta la sensibilidad y permite la detección de eventos raros, especialmente variantes de un solo nucleótido (SNV), al aislar o disminuir en gran medida la señal del biomarcador objetivo del fondo potencialmente competitivo. [9] [6] Estos eventos se pueden organizar en dos clases: detección de mutaciones raras y detección de secuencias raras.

Detección de mutaciones raras

La detección de mutaciones raras ocurre cuando un biomarcador existe en un contexto de un homólogo muy abundante que difiere solo en una variante de un solo nucleótido (SNV). Se ha demostrado que la PCR digital es capaz de detectar ADN mutante en presencia de un exceso de 200.000 veces del contexto de tipo salvaje , lo que es 2.000 veces más sensible que lo que se puede lograr con la qPCR convencional. [9]

Detección de secuencias raras

La PCR digital puede detectar secuencias raras como ADN del VIH en pacientes con VIH, [24] y ADN de bacterias fecales en muestras de océano y otras aguas para evaluar la calidad del agua. [79] La dPCR puede detectar secuencias tan raras como 1 en cada 1.250.000 células. [24]

Biopsia liquida

La capacidad de la dPCR para detectar mutaciones raras puede ser particularmente beneficiosa en la clínica a través del uso de la biopsia líquida , una estrategia generalmente no invasiva para detectar y monitorear enfermedades a través de fluidos corporales. [17] [80] Los investigadores han utilizado la biopsia líquida para monitorear la carga tumoral, la respuesta al tratamiento y la progresión de la enfermedad en pacientes con cáncer midiendo mutaciones raras en el ADN tumoral circulante (ctDNA) en una variedad de fluidos biológicos de pacientes, incluyendo sangre , orina y líquido cefalorraquídeo . [17] [81] [82] La detección temprana de ctDNA (como en la recaída molecular ) puede conducir a la administración temprana de una inmunoterapia o una terapia dirigida específica para la firma de mutación del paciente, mejorando potencialmente las posibilidades de efectividad del tratamiento en lugar de esperar una recaída clínica antes de alterar el tratamiento. Las biopsias líquidas pueden tener tiempos de respuesta de unos pocos días, en comparación con dos a cuatro semanas o más para las pruebas basadas en tejidos. [83] [84] Este tiempo reducido para obtener resultados ha sido utilizado por los médicos para agilizar los tratamientos adaptados a los datos de la biopsia . [83]

En 2016, un ensayo prospectivo que utilizó dPCR en el Instituto de Cáncer Dana-Farber autenticó el beneficio clínico de la biopsia líquida como herramienta de diagnóstico predictivo para pacientes con cáncer de pulmón de células no pequeñas . [85] La aplicación de pruebas de biopsia líquida también se ha estudiado en pacientes con cáncer de mama , [86] colorrectal , [87] [88] ginecológico , [89] y de vejiga [81] [90] para monitorear tanto la carga de la enfermedad como la respuesta del tumor al tratamiento.

Expresión génica y cuantificación del ARN

Los estudios de expresión genética y cuantificación de ARN se han beneficiado de la mayor precisión y cuantificación absoluta de la dPCR. [91] La cuantificación de ARN se puede lograr a través de RT-PCR , en donde el ARN se transcribe de manera inversa en ADNc en la propia reacción particionada, y la cantidad de moléculas de ARN que se originan a partir de cada transcripción (o transcripción alélica) se cuantifica a través de dPCR. [31]

A menudo se puede lograr una mayor sensibilidad y precisión utilizando dPCR en lugar de qPCR para cuantificar moléculas de ARN, en parte porque no requiere el uso de una curva estándar para la cuantificación. [92] La dPCR también es más resistente a los inhibidores de PCR para la cuantificación de ARN que la qPCR. [48] [16] [91]

La dPCR puede detectar y cuantificar más especies diana individuales por canal de detección que la qPCR en virtud de poder distinguir dianas en función de su amplitud de fluorescencia diferencial o mediante el uso de combinaciones de colores distintivas para su detección. [93] [91] Como ejemplo de esto, se ha utilizado un sistema dPCR de 2 canales para detectar en un solo pocillo la expresión de cuatro variantes de empalme diferentes de la transcriptasa inversa de la telomerasa humana , una proteína que es más activa en la mayoría de las células tumorales que en las células sanas. [94]

Usos alternativos para la partición

Utilizando las capacidades de partición dinámica empleadas en dPCR, se puede lograr una secuenciación NGS mejorada mediante la partición de reacciones de PCR complejas antes de la amplificación para dar una amplificación más uniforme a través de muchos amplicones distintos para el análisis NGS . [95] [96] Además, se ha demostrado que la especificidad mejorada de las reacciones de amplificación de PCR complejas en gotas reduce en gran medida el número de iteraciones necesarias para seleccionar aptámeros de alta afinidad en el método SELEX . [97] La ​​partición también puede permitir mediciones más robustas de la actividad de la telomerasa a partir de lisados ​​​​celulares. [98] [99] Las capacidades de partición dinámica de dPCR también se pueden utilizar para particionar miles de núcleos o células completas en gotas individuales para facilitar la preparación de la biblioteca para un ensayo de una sola célula para cromatina accesible a la transposasa utilizando secuenciación  (scATAC-seq). [100]

PCR digital de gotas

La PCR digital de gotas (ddPCR) es un método de dPCR en el que una reacción de muestra de 20 microlitros que incluye cebadores de ensayo y sondas Taqman o un colorante intercalante, se divide en gotas de aceite de aproximadamente 20 000 nanolitros mediante una técnica de emulsión de agua-aceite , se termocicla hasta el punto final en una placa de PCR de 96 pocillos y se lee la amplitud de fluorescencia de todas las gotas en cada pocillo de muestra en un citómetro de flujo de gotas. [101]

PCR digital basada en chip

La PCR digital basada en chip (dPCR) también es un método de dPCR en el que la mezcla de reacción (también cuando se utiliza en qPCR) se divide en ~10 000 a ~45 000 particiones en un chip, luego se amplifica utilizando una máquina de termociclado de PCR de punto final y se lee utilizando un lector de cámara de alta potencia con filtro de fluorescencia (HEX, FAM, Cy5, Cy5.5 y Texas Red) para todas las particiones en cada chip. [102]

Historia

La dPCR surgió de un enfoque publicado por primera vez en 1988 por Cetus Corporation cuando los investigadores demostraron que una única copia del gen de la β-globina podía detectarse y amplificarse mediante PCR. [103] [104] Esto se logró diluyendo muestras de ADN de una línea celular humana normal con ADN de una línea mutante que tenía una deleción homocigótica del gen de la β-globina, hasta que ya no estaba presente en la reacción. En 1989, Peter Simmonds, AJ Brown et al. utilizaron este concepto para cuantificar una molécula por primera vez. [105] Alex Morley y Pamela Sykes establecieron formalmente el método como una técnica cuantitativa en 1992. [46]

En 1999, Bert Vogelstein y Kenneth Kinzler acuñaron el término “PCR digital” y demostraron que la técnica podía utilizarse para encontrar mutaciones raras del cáncer. [106] Sin embargo, la dPCR era difícil de realizar; exigía mucho trabajo, mucha formación para realizarla correctamente y era difícil de realizar en grandes cantidades. [106] En 2003, Kinzler y Vogelstein continuaron perfeccionando la dPCR y crearon un método mejorado al que llamaron tecnología BEAMing , un acrónimo de “perlas, emulsión, amplificación y magnetismo”. El nuevo protocolo utilizaba emulsión para compartimentar las reacciones de amplificación en un solo tubo. Este cambio hizo posible que los científicos escalaran el método a miles de reacciones en una sola ejecución. [107] [108] [109]

Las empresas que desarrollan sistemas comerciales de dPCR han integrado tecnologías como la partición automatizada de muestras, el recuento digital de objetivos de ácidos nucleicos y el aumento del recuento de gotas que pueden ayudar a que el proceso sea más eficiente. [110] [111] [112] En los últimos años, los científicos han desarrollado y comercializado diagnósticos basados ​​en dPCR para varias afecciones, incluido el cáncer de pulmón de células no pequeñas y el síndrome de Down . [113] [114] El primer sistema de dPCR para uso clínico recibió la marca CE en 2017 y fue aprobado por la Administración de Alimentos y Medicamentos de EE. UU. en 2019, para diagnosticar la leucemia mieloide crónica . [115]

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