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ARN ribosómico 16S

Estructura molecular de la subunidad 30S de Thermus thermophilus . Las proteínas se muestran en azul y la hebra única de ARN en un color naranja-marrón pálido. [1]

El ARN ribosómico 16 S (o ARNr 16 S ) es el componente de ARN de la subunidad 30S de un ribosoma procariota ( ARNr SSU ). Se une a la secuencia Shine-Dalgarno y proporciona la mayor parte de la estructura SSU.

Los genes que lo codifican se denominan genes ARNr 16S y se utilizan para reconstruir filogenias , debido a las lentas tasas de evolución de esta región del gen. [2] Carl Woese y George E. Fox fueron dos de las personas que fueron pioneras en el uso del ARNr 16S en filogenia en 1977. [3] Pueden existir múltiples secuencias del gen ARNr 16S dentro de una sola bacteria . [4]

Funciones

Estructura

SSU ARN ribosómico, bacterias y arqueas. Tomado de Woese 1987. [6]

Cebadores universales

El gen 16S rRNA se utiliza para estudios filogenéticos [7] ya que está altamente conservado entre diferentes especies de bacterias y arqueas. [8] Carl Woese fue pionero en este uso de 16S rRNA en 1977. [2] Se sugiere que el gen 16S rRNA se puede utilizar como un reloj molecular confiable porque se ha demostrado que las secuencias de 16S rRNA de linajes bacterianos distantemente relacionados tienen funcionalidades similares. [9] Algunas arqueas termófilas (por ejemplo, el orden Thermoproteales ) contienen intrones del gen 16S rRNA que se encuentran en regiones altamente conservadas y pueden afectar la hibridación de cebadores "universales" . [10] El ARNr mitocondrial y cloroplástico también se amplifica. [11]

El par de cebadores más común fue ideado por Weisburg et al. (1991) [7] y actualmente se lo conoce como 27F y 1492R; sin embargo, para algunas aplicaciones pueden ser necesarios amplicones más cortos , por ejemplo, para la secuenciación 454 con química de titanio, el par de cebadores 27F-534R cubre V1 a V3. [12] A menudo se utiliza 8F en lugar de 27F. Los dos cebadores son casi idénticos, pero 27F tiene una M en lugar de una C. AGAGTTTGATC M TGGCTCAG en comparación con 8F. [13]

Aplicaciones de PCR y NGS

Además de los sitios de unión de cebadores altamente conservados, las secuencias del gen ARNr 16S contienen regiones hipervariables que pueden proporcionar secuencias distintivas específicas de especies útiles para la identificación de bacterias. [21] [22] Como resultado, la secuenciación del gen ARNr 16S se ha vuelto frecuente en la microbiología médica como una alternativa rápida y barata a los métodos fenotípicos de identificación bacteriana. [23] Aunque originalmente se utilizó para identificar bacterias, posteriormente se descubrió que la secuenciación 16S era capaz de reclasificar bacterias en especies completamente nuevas , [24] o incluso géneros . [7] [25] También se ha utilizado para describir nuevas especies que nunca se han cultivado con éxito. [26] [27] Con la secuenciación de tercera generación llegando a muchos laboratorios, la identificación simultánea de miles de secuencias de ARNr 16S es posible en cuestión de horas, lo que permite estudios metagenómicos , por ejemplo de la flora intestinal . [28] En muestras recolectadas de pacientes con infecciones confirmadas, la secuenciación de próxima generación (NGS) del ARNr 16S demostró una detección mejorada en el 40% de los casos en comparación con los métodos de cultivo tradicionales; además, el consumo de antibióticos antes del muestreo no afectó significativamente la sensibilidad de la NGS 16S. [29]

Regiones hipervariables

El gen bacteriano 16S contiene nueve regiones hipervariables (V1-V9), que van desde aproximadamente 30 a 100 pares de bases de longitud, que están involucradas en la estructura secundaria de la subunidad ribosomal pequeña . [30] El grado de conservación varía ampliamente entre regiones hipervariables, con regiones más conservadas correlacionadas con una taxonomía de nivel superior y regiones menos conservadas con niveles inferiores, como género y especie. [31] Si bien la secuencia completa de 16S permite la comparación de todas las regiones hipervariables, con aproximadamente 1500 pares de bases de longitud, puede ser prohibitivamente costosa para estudios que buscan identificar o caracterizar diversas comunidades bacterianas. [31] Estos estudios comúnmente utilizan la plataforma Illumina , que produce lecturas a tasas 50 veces y 12 000 veces menos costosas que la pirosecuenciación 454 y la secuenciación de Sanger , respectivamente. [32] Si bien es más económica y permite una cobertura más profunda de la comunidad, la secuenciación de Illumina solo produce lecturas de 75 a 250 pares de bases de longitud (hasta 300 pares de bases con Illumina MiSeq) y no tiene un protocolo establecido para ensamblar de manera confiable el gen completo en muestras de la comunidad. [33] Sin embargo, las regiones hipervariables completas se pueden ensamblar a partir de una sola ejecución de Illumina, lo que las convierte en objetivos ideales para la plataforma. [33]

Si bien las regiones hipervariables 16S pueden variar drásticamente entre bacterias, el gen 16S en su conjunto mantiene una mayor homogeneidad de longitud que su contraparte eucariota ( ARN ribosómico 18S ), lo que puede facilitar las alineaciones . [34] Además, el gen 16S contiene secuencias altamente conservadas entre regiones hipervariables, lo que permite el diseño de cebadores universales que pueden producir de manera confiable las mismas secciones de la secuencia 16S en diferentes taxones . [35] Aunque ninguna región hipervariable puede clasificar con precisión todas las bacterias desde el dominio hasta la especie, algunas pueden predecir de manera confiable niveles taxonómicos específicos. [31] Muchos estudios comunitarios seleccionan regiones hipervariables semiconservadas como la V4 por esta razón, ya que puede proporcionar resolución a nivel de filo con tanta precisión como el gen 16S completo. [31] Si bien las regiones menos conservadas luchan por clasificar nuevas especies cuando se desconoce la taxonomía de orden superior, a menudo se utilizan para detectar la presencia de patógenos específicos. En un estudio de Chakravorty et al. En 2007, los autores caracterizaron las regiones V1-V8 de una variedad de patógenos para determinar qué regiones hipervariables serían más útiles para incluir en ensayos amplios y específicos de la enfermedad . [36] Entre otros hallazgos, notaron que la región V3 era la mejor para identificar el género de todos los patógenos evaluados, y que la V6 era la más precisa para diferenciar especies entre todos los patógenos evaluados y observados por los CDC , incluido el ántrax . [36]

Si bien el análisis de la región hipervariable 16S es una herramienta poderosa para los estudios taxonómicos bacterianos, tiene dificultades para diferenciar entre especies estrechamente relacionadas. [35] En las familias Enterobacteriaceae , Clostridiaceae y Peptostreptococcaceae , las especies pueden compartir hasta un 99% de similitud de secuencia en todo el gen 16S. [37] Como resultado, las secuencias V4 pueden diferir en solo unos pocos nucleótidos , lo que deja a las bases de datos de referencia incapaces de clasificar de manera confiable estas bacterias en niveles taxonómicos más bajos. [37] Al limitar el análisis 16S para seleccionar regiones hipervariables, estos estudios pueden no observar diferencias en taxones estrechamente relacionados y agruparlos en unidades taxonómicas individuales, subestimando así la diversidad total de la muestra. [35] Además, los genomas bacterianos pueden albergar múltiples genes 16S, y las regiones V1, V2 y V6 contienen la mayor diversidad intraespecie. [8] Si bien no es el método más preciso para clasificar las especies bacterianas, el análisis de las regiones hipervariables sigue siendo una de las herramientas más útiles disponibles para los estudios de la comunidad bacteriana. [37]

Promiscuidad de los genes del ARNr 16S

Bajo el supuesto de que la evolución es impulsada por la transmisión vertical , durante mucho tiempo se ha creído que los genes 16S rRNA son específicos de la especie e infalibles como marcadores genéticos que infieren relaciones filogenéticas entre procariotas . Sin embargo, un número creciente de observaciones sugieren la ocurrencia de transferencia horizontal de estos genes. Además de las observaciones de ocurrencia natural, la transferibilidad de estos genes se apoya experimentalmente utilizando un sistema genético especializado de Escherichia coli . Usando un mutante nulo de E. coli como huésped, se demostró que el crecimiento de la cepa mutante se complementaba con genes 16S rRNA extraños que eran filogenéticamente distintos de E. coli a nivel de filo. [38] [39] Dicha compatibilidad funcional también se vio en Thermus thermophilus . [40] Además, en T. thermophilus , se observó transferencia genética tanto completa como parcial. La transferencia parcial resultó en la generación espontánea de quimeras aparentemente aleatorias entre el huésped y los genes bacterianos extraños. Por lo tanto, los genes 16S rRNA pueden haber evolucionado a través de múltiples mecanismos, incluyendo la herencia vertical y la transferencia genética horizontal ; La frecuencia de este último puede ser mucho mayor de lo que se creía anteriormente. [41]

Bases de datos del ribosoma 16S

El gen ARNr 16S se utiliza como estándar para la clasificación e identificación de microbios, porque está presente en la mayoría de los microbios y muestra cambios adecuados. [42] Las cepas tipo de secuencias del gen ARNr 16S para la mayoría de las bacterias y arqueas están disponibles en bases de datos públicas, como NCBI . Sin embargo, la calidad de las secuencias que se encuentran en estas bases de datos a menudo no está validada. Por lo tanto, se utilizan ampliamente bases de datos secundarias que recopilan solo secuencias de ARNr 16S.

MIMt

MIMt es una base de datos 16S compacta y no redundante para la identificación rápida de muestras metagenómicas. Está compuesta por 39.940 secuencias 16S completas pertenecientes a 17.625 especies de bacterias y arqueas bien clasificadas. Todas las secuencias se obtuvieron de genomas completos depositados en NCBI y para cada una de las secuencias se proporciona una jerarquía taxonómica completa. No contiene redundancia, por lo que solo se consideró un representante para cada especie, evitando las mismas secuencias de diferentes cepas, aislados o patovares, lo que resulta en una herramienta muy rápida para la identificación de microorganismos, compatible con cualquier software de clasificación (QIIME, Mothur, DADA, etc.). [43]

Nube EzBio

La base de datos EzBioCloud, anteriormente conocida como EzTaxon , consiste en un sistema taxonómico jerárquico completo que contiene 62.988 especies/filotipos de bacterias y arqueas que incluyen 15.290 nombres válidos publicados a septiembre de 2018. Según la relación filogenética, como la máxima verosimilitud y OrthoANI, todas las especies/subespecies están representadas por al menos una secuencia del gen 16S rRNA. La base de datos EzBioCloud se cura y actualiza sistemáticamente de forma regular, e incluye también nuevas especies candidatas. Además, el sitio web proporciona herramientas bioinformáticas como la calculadora ANI, ContEst16S y 16S rRNA DB para QIIME y Mothur pipeline. [44] ^^

Proyecto de base de datos de ribosomas

El Ribosomal Database Project (RDP) es una base de datos curada que ofrece datos de ribosomas junto con programas y servicios relacionados. Las ofertas incluyen alineaciones ordenadas filogenéticamente de secuencias de ARN ribosómico (ARNr), árboles filogenéticos derivados, diagramas de estructura secundaria de ARNr y varios paquetes de software para manejar, analizar y mostrar alineaciones y árboles. Los datos están disponibles a través de FTP y correo electrónico. El servidor de correo electrónico también proporciona ciertos servicios analíticos. [45] Debido a su gran tamaño, la base de datos RDP se utiliza a menudo como base para el desarrollo de herramientas bioinformáticas y la creación de bases de datos curadas manualmente. [46]

SILVA

SILVA proporciona conjuntos de datos completos, de calidad comprobada y actualizados periódicamente de secuencias de ARN ribosómico (ARNr) alineadas de subunidades pequeñas (16S/ 18S , SSU ) y grandes ( 23S / 28S , LSU ) para los tres dominios de la vida, así como un conjunto de herramientas de búsqueda, diseño de cebadores y alineación (Bacteria, Archaea y Eukarya). [47]

Genes verdes

GreenGenes es una base de datos de referencia de genes ARNr 16S integral y de calidad controlada, y una taxonomía basada en una filogenia de novo que proporciona conjuntos de unidades taxonómicas operativas estándar. Tenga en cuenta que utiliza términos taxonómicos propuestos a partir de métodos filogenéticos aplicados hace años entre 2012 y 2013. Desde entonces, se han propuesto diversos métodos filogenéticos novedosos para arqueas y bacterias. [48] [49]

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