El ADN de transferencia (abreviado T-DNA ) es el ADN transferido del plásmido inductor de tumores (Ti) de algunas especies de bacterias como Agrobacterium tumefaciens y Agrobacterium rhizogenes (en realidad un plásmido Ri) . El ADN-T se transfiere de la bacteria al genoma de ADN nuclear de la planta huésped . [1] La capacidad de este plásmido especializado en inducir tumores (Ti) se atribuye a dos regiones esenciales necesarias para la transferencia de ADN a la célula huésped. El ADN-T está bordeado por repeticiones de 25 pares de bases en cada extremo. La transferencia se inicia en el borde derecho y termina en el borde izquierdo y requiere los genes vir del plásmido Ti.
El ADN-T bacteriano tiene aproximadamente 24.000 pares de bases de largo [2] [3] y contiene genes expresados en plantas que codifican enzimas que sintetizan opiniones y fitohormonas . Al transferir el ADN-T al genoma de la planta, la bacteria esencialmente reprograma las células de la planta para que crezcan hasta convertirse en un tumor y produzcan una fuente de alimento única para la bacteria. La síntesis de las hormonas vegetales auxina y citoquinina por enzimas codificadas en el ADN-T permite que la célula vegetal crezca excesivamente, formando así los tumores de agalla de la corona típicamente inducidos por la infección por Agrobacterium tumefaciens . [4] Agrobacterium rhizogenes causa una infección similar conocida como enfermedad de la raíz peluda . Las opiniones son derivados de aminoácidos utilizados por la bacteria como fuente de carbono y energía. Este proceso natural de transferencia horizontal de genes en plantas se está utilizando como herramienta para la investigación fundamental y aplicada en biología vegetal a través de la transformación de genes extraños mediada por Agrobacterium tumefaciens y la mutagénesis de inserción. [5] [6] Los genomas de plantas se pueden diseñar mediante el uso de Agrobacterium para la entrega de secuencias alojadas en vectores binarios de ADN-T .
El proceso de infección del ADN-T en la célula huésped y la integración en su núcleo implica múltiples pasos. Primero, las bacterias se multiplican en la savia de la herida antes de la infección y luego se adhieren a las paredes celulares de las plantas. La expresión de los genes de virulencia bacteriana de aproximadamente 10 operones se activa mediante la percepción de compuestos fenólicos como la acetosiringona emitidos por el tejido vegetal herido y sigue el contacto entre células. Luego, este proceso continúa con la translocación macromolecular de Agrobacterium al citoplasma de la célula huésped, la transmisión del ADN-T junto con las proteínas asociadas (llamadas complejo T ) al núcleo de la célula huésped, seguido del desmontaje del complejo T, integración estable de T- ADN en el genoma de la planta huésped y eventual expresión de los genes transferidos . La integración del ADN-T en el genoma del huésped implica la formación de una mella monocatenaria en el ADN en el borde derecho del plásmido Ti. Esta mella crea una región de ADN monocatenario desde el borde izquierdo del gen T-DNA hasta el borde derecho que se cortó. Luego, las proteínas de unión monocatenarias se unen al ADN monocatenario. La síntesis de ADN desplaza la región monocatenaria y luego una segunda muesca en la región del borde izquierdo libera el fragmento de ADN T monocatenario. Además, este fragmento puede incorporarse a un genoma huésped. [7]
Se sabe que Agrobacterium ha desarrollado un sistema de control que utiliza factores de la planta huésped y procesos celulares para varias vías de respuesta de defensa de la planta huésped para invadir el núcleo de la célula huésped. Para la integración del ADN-T en el genoma del huésped objetivo, Agrobacterium lleva a cabo múltiples interacciones con factores de la planta huésped. [7] Para interactuar con las proteínas de la planta huésped, muchas proteínas de virulencia de Agrobacterium codificadas por genes vir. La expresión del gen Agrobacterium vir se produce a través del sensor VirA-VirG que da como resultado la generación de una copia móvil de ADN T monocatenario (cadena T). Una forma procesada de VirB2 es el componente principal del complejo T necesario para la transformación. VirD2 es la proteína que recubre el extremo 5' de la cadena T transferida mediante unión covalente y se transporta al citoplasma de la célula huésped. [8] [9] VirE2 es la proteína de unión al ADN monocatenario que presumiblemente recubre la cadena T en el citoplasma del huésped mediante unión cooperativa . Luego se dirige al núcleo mediante interacciones con las proteínas de la célula huésped, como la importina a, el VirE3 bacteriano y las proteínas similares a la dineína. Varios otros efectores de virulencia bacteriana como VirB5, VirB7 (los componentes menores del complejo T), VirD5, VirE2, VirE3 y VirF que también pueden interactuar con proteínas de las células de la planta huésped. [10]
La transferencia de ADN-T mediada por Agrobacterium se utiliza ampliamente como herramienta en biotecnología . Durante más de dos décadas, Agrobacterium tumefaciens ha sido explotado para introducir genes en plantas para investigación básica, así como para la producción comercial de cultivos transgénicos . [11] En ingeniería genética , los genes promotores de tumores y de síntesis de opinión se eliminan del ADN-T y se reemplazan con un gen de interés y/o un marcador de selección, que se requiere para establecer qué plantas se han transformado con éxito. Ejemplos de marcadores de selección incluyen neomicina fosfotransferasa, higromicina B fosfotransferasa (que fosforilan antibióticos) y fosfinotricina acetiltransferasa (que acetila y desactiva la fosfinotricina , un potente inhibidor de la glutamina sintetasa ) o formulaciones herbicidas como Basta o Bialophos. [12] Otro sistema de selección que se puede emplear es el uso de marcadores metabólicos como la fosfomanosa isomerasa. [13] Luego se utiliza Agrobacterium como vector para transferir el ADN-T modificado a las células vegetales, donde se integra en el genoma de la planta. Este método se puede utilizar para generar plantas transgénicas que porten un gen extraño. Agrobacterium tumefaciens es capaz de transferir ADN extraño tanto a plantas monocotiledóneas como a dicotiledóneas de manera eficiente mientras cuida factores de importancia crítica como el genotipo de las plantas, tipos y edades de los tejidos inoculados, tipos de vectores, cepas de Agrobacterium , genes marcadores de selección y agentes selectivos. y diversas condiciones del cultivo de tejidos. [4]
Se puede utilizar el mismo procedimiento de transferencia de ADN-T para alterar genes mediante mutagénesis por inserción . [6] La secuencia de ADN-T insertada no sólo crea una mutación, sino que su inserción también "marca" [14] el gen afectado, permitiendo así su aislamiento como secuencias flanqueantes de ADN-T. Un gen indicador se puede vincular al extremo derecho del ADN-T que se va a transformar junto con un replicón de plásmido y un gen de resistencia a antibióticos seleccionable (como la higromicina ) y puede expresar aproximadamente un 30% de eficiencia promedio con inserciones de ADN-T exitosas. Fusiones de genes inducidas en Arabidopsis thaliana . [15]
La genética inversa implica probar la supuesta función de un gen que se conoce al alterarlo y luego buscar el efecto de esa mutación inducida en el fenotipo del organismo. La mutagénesis con etiquetado de ADN-T implica la detección de poblaciones mediante mutaciones de inserción de ADN-T. Las colecciones de mutaciones conocidas del ADN-T proporcionan recursos para estudiar las funciones de genes individuales, tal como se desarrollaron para la planta modelo Arabidopsis thaliana . [16] Los ejemplos de mutaciones de inserción de ADN-T en Arabidopsis thaliana incluyen aquellas asociadas a muchas clases de fenotipos que incluyen plantas letales para plántulas, variantes de tamaño, variantes de pigmento, embriones defectuosos, fertilidad reducida y plantas morfológica o fisiológicamente aberrantes. [17]