La cristalografía resuelta en el tiempo utiliza imágenes de cristalografía de rayos X para visualizar reacciones en cuatro dimensiones (x, y, z y tiempo). Esto permite el estudio de los cambios dinámicos que ocurren, por ejemplo, en las enzimas durante su catálisis. La dimensión temporal se incorpora desencadenando la reacción de interés en el cristal antes de la exposición a los rayos X y luego recopilando los patrones de difracción en diferentes retrasos temporales. Para estudiar estas propiedades dinámicas de las macromoléculas, se deben cumplir tres criterios: [1]
Esto ha llevado al desarrollo de varias técnicas que pueden dividirse en dos grupos, el método de bombeo-sonda y los métodos de difusión-atrapamiento.
En el método de bombeo-sonda, la reacción se desencadena primero (bombeo) mediante fotólisis (generalmente luz láser) y luego se recoge un patrón de difracción mediante un pulso de rayos X (sonda) con un retraso de tiempo específico. Esto permite obtener muchas imágenes con diferentes retrasos de tiempo después de la activación de la reacción y, de ese modo, construir una serie cronológica de imágenes que describen los eventos durante la reacción. Para obtener una relación señal-ruido razonable, este ciclo de bombeo-sonda debe realizarse muchas veces para cada rotación espacial del cristal y muchas veces para el mismo retraso de tiempo. Por lo tanto, la reacción que se desea estudiar con el método de bombeo-sonda debe poder relajarse y volver a su conformación original después de la activación, lo que permite realizar muchas mediciones en la misma muestra. La resolución temporal de los fenómenos observados está determinada por el ancho temporal del pulso de sondeo ( ancho completo a la mitad del máximo ). Todos los procesos que ocurren en una escala de tiempo más rápida que esa se promediarán mediante la convolución de la intensidad del pulso de la sonda en el tiempo con la intensidad de la reflectividad de rayos X real de la muestra.
Los métodos de difusión-atrapamiento utilizan técnicas de difusión para introducir los sustratos en el cristal y, a continuación, se aplican diferentes técnicas de atrapamiento para conseguir que el intermedio de interés se acumule en el cristal antes de recoger el patrón de difracción. Estos métodos de atrapamiento podrían implicar cambios en el pH , [2] el uso de inhibidores [3] o la reducción de la temperatura para reducir la velocidad de recambio o incluso detener la reacción por completo en un paso específico. También es posible iniciar la reacción y luego congelarla instantáneamente [4] , extinguiéndola así en un paso de tiempo específico. Un inconveniente de los métodos de difusión-atrapamiento es que solo se pueden utilizar para estudiar intermedios que se pueden atrapar, lo que limita la resolución temporal que se puede obtener a través de los métodos en comparación con el método de bombeo-sonda.