La criofijación es una técnica para la fijación o estabilización de materiales biológicos como primer paso en la preparación de muestras para microscopía electrónica y microscopía crioelectrónica . [1] Las muestras típicas para la criofijación incluyen pequeñas muestras de tejido vegetal o animal , suspensiones celulares de microorganismos o células cultivadas , suspensiones de virus o cápsidas de virus y muestras de macromoléculas purificadas , especialmente proteínas . [2] [3]
Tipos de criofijación [ cita necesaria ] [ aclaración necesaria ]
1.Liofilización-secado [ cita necesaria ]
2.Sustitución por congelación [ cita necesaria ]
3.grabado por congelación [ cita necesaria ] [ aclaración necesaria ]
El método implica el enfriamiento ultrarrápido de pequeñas muestras de tejido o células a la temperatura del nitrógeno líquido (-196 °C) o menos, deteniendo todo movimiento y actividad metabólica y preservando la estructura interna congelando todas las fases fluidas como sólidas. Normalmente, una muestra se sumerge en nitrógeno líquido o en etano líquido o propano líquido en un recipiente enfriado con nitrógeno líquido. El objetivo final es congelar el espécimen tan rápidamente (entre 10 4 y 10 6 K por segundo) que los cristales de hielo no puedan formarse, o se les impida que crezcan lo suficiente como para causar daños a la ultraestructura del espécimen . La formación de muestras que contienen especímenes en hielo amorfo es el " santo grial " de la criomicroscopía biológica. [ cita necesaria ]
En la práctica, es muy difícil lograr velocidades de enfriamiento suficientemente altas como para producir hielo amorfo en muestras de más de unos pocos micrómetros de espesor. Para ello, sumergir una muestra en nitrógeno líquido en su punto de ebullición (-196 °C) [4] no siempre congela la muestra lo suficientemente rápido, por varias razones. Primero, el nitrógeno líquido hierve rápidamente alrededor de la muestra formando una película de N aislante.
2gas que ralentiza la transferencia de calor al líquido criogénico, conocido como efecto Leidenfrost . Las velocidades de enfriamiento se pueden mejorar bombeando nitrógeno líquido con una bomba de vacío de paletas rotativas durante unas pocas decenas de segundos antes de sumergir la muestra en ella. Esto reduce la temperatura del nitrógeno líquido por debajo de su punto de ebullición, de modo que cuando la muestra se sumerge en él, la envuelve estrechamente durante un breve período de tiempo y extrae calor de ella de manera más eficiente. Se puede obtener un enfriamiento aún más rápido sumergiendo las muestras en propano líquido o etano (se ha descubierto que el etano es más eficiente) [5] enfriadas muy cerca de sus puntos de fusión usando nitrógeno líquido [6] o golpeando la muestra contra nitrógeno líquido altamente pulido. -Superficies metálicas refrigeradas de cobre o plata . [7] En segundo lugar, dos propiedades del agua impiden la criofijación rápida en muestras grandes. [8] La conductividad térmica del hielo es muy baja en comparación con la de los metales , y el agua libera calor latente de fusión a medida que se congela, lo que anula el rápido enfriamiento en muestras de más de unos pocos micrómetros de espesor.
La alta presión ayuda a prevenir la formación de grandes cristales de hielo. La congelación rápida autopresurizada (SPRF) puede utilizar muchos criógenos diferentes y recientemente se ha promocionado como una alternativa atractiva y de bajo costo a la congelación a alta presión (HPF). [9] El nitrógeno presurizado en frío sustituye al etanol a temperaturas de aproximadamente 123 K. El etanol tibio luego es expulsado por el LN2 congelado y muy probablemente produce una mezcla de etanol y nitrógeno que gradualmente se vuelve cada vez más fría.
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Los tiempos de secado se reducen hasta en un 30% con una liofilización adecuada. [11]