Un cósmido es un tipo de plásmido híbrido que contiene una secuencia cos del fago Lambda . [1] A menudo se utilizan como vector de clonación en ingeniería genética . Los cósmidos se pueden utilizar para construir bibliotecas genómicas . Fueron descritos por primera vez por Collins y Hohn en 1978. [2] Los cósmidos pueden contener de 37 a 52 (normalmente 45) kb de ADN, límites basados en el tamaño normal del empaque de los bacteriófagos. Pueden replicarse como plásmidos si tienen un origen de replicación (ori) adecuado: por ejemplo, ori SV40 en células de mamíferos, ori ColE1 para la replicación de ADN bicatenario o ori f1 para la replicación de ADN monocatenario en procariotas . Con frecuencia también contienen un gen para la selección, como la resistencia a los antibióticos , de modo que las células transformadas puedan identificarse sembrando en placas un medio que contenga el antibiótico. Aquellas células que no absorbieran el cósmido no podrían crecer. [3]
A diferencia de los plásmidos, también se pueden empaquetar in vitro en cápsidas de fagos , un paso que requiere extremos cohesivos , también conocidos como sitios cos , que también se utilizan en la clonación con un fago lambda como vector; sin embargo, casi todos los genes lambda se han eliminado con la excepción. de la secuencia cos . El ADN cósmido híbrido de las cápsidas puede luego transferirse a células bacterianas mediante transducción . Dado que existe un requisito para el empaquetado in vitro mediante el cual se requieren al menos 38 kb de ADN entre los sitios cos, el vector sin ADN insertado no se empaquetará (la inestabilidad de los plásmidos aumenta si el nuevo ADN insertado contiene muchas repeticiones directas o palindrómicas (invertidas). repeticiones) ADN. Esta inestabilidad se puede contrarrestar en gran medida mediante el uso de una bacteria huésped con mutaciones específicas que afectan la recombinación del ADN (NB: la ausencia de repeticiones invertidas se observó en la primera publicación de Hohn & Collins citada anteriormente; ver también [4] ).
Las secuencias cos tienen aproximadamente 200 pares de bases de largo y son esenciales para el empaquetado. Contienen un sitio cosN donde la terminasa corta el ADN en cada hebra, con una separación de 12 pb. Esto provoca la linealización del cósmido circular con dos extremos "cohesivos" o "pegajosos" de 12 pb. (El ADN debe ser lineal para caber en la cabeza de un fago). El sitio cosB sostiene la terminasa mientras corta y separa las hebras. El sitio cosQ del siguiente cósmido (ya que la replicación del círculo rodante a menudo resulta en concatémeros lineales ) lo mantiene la terminasa después de que el cósmido anterior ha sido empaquetado, para evitar la degradación por las ADNasas celulares .
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Los cósmidos son predominantemente plásmidos con un oriV bacteriano , un marcador de selección de antibióticos y un sitio de clonación, pero llevan uno, o más recientemente dos, sitios cos derivados del bacteriófago lambda. Dependiendo del objetivo particular del experimento, se encuentran disponibles cósmidos de amplio rango de huéspedes, cósmidos lanzadera o cósmidos "mamíferos" (vinculados a SV40 oriV y marcadores de selección de mamíferos). La capacidad de carga de los cósmidos varía según el tamaño del propio vector, pero suele oscilar entre 40 y 45 kb. El procedimiento de clonación implica la generación de dos brazos vectoriales que luego se unen al ADN extraño. La selección frente al ADN cósmido de tipo salvaje se realiza simplemente mediante exclusión por tamaño. Por tanto, los cósmidos siempre forman colonias y no placas. Además, la densidad de clones es mucho menor, con alrededor de 10 5 – 10 6 UFC por µg de ADN ligado.
Después de la construcción de bibliotecas de cósmidos o lambda recombinantes, el ADN total se transfiere a un huésped de E. coli apropiado mediante una técnica llamada empaquetado in vitro. Los extractos de embalaje necesarios se derivan de lisógenos de E. coli cI857 (red-gam-Sam y Dam (conjunto de cabeza) y Eam (conjunto de cola) respectivamente). Estos extractos reconocerán y empaquetarán las moléculas recombinantes in vitro , generando partículas de fagos maduras (vectores basados en lambda) o plásmidos recombinantes contenidos en cubiertas de fagos (cósmidos). Estas diferencias se reflejan en las diferentes frecuencias de infección observadas a favor de los vectores de reemplazo lambda. Esto compensa su capacidad de carga ligeramente menor. Las bibliotecas de fagos también se almacenan y analizan más fácilmente que las bibliotecas de cósmidos.
ADN objetivo: el ADN genómico que se va a clonar debe cortarse en fragmentos de restricción del rango de tamaño adecuado. Esto generalmente se hace mediante restricción parcial seguida de fraccionamiento por tamaño o desfosforilación (usando fosfatasa del intestino de ternera) para evitar la codificación cromosómica, es decir, la ligadura de fragmentos físicamente no unidos.
Los vectores más utilizados incluyen "SuperCos 1"