Secciones delgadas de tejido pulmonar utilizadas en investigación respiratoria
Los cortes de pulmón de precisión o PCLS son cortes finos de tejido pulmonar que se preparan con gran precisión y que se utilizan normalmente con fines experimentales en el campo de la investigación respiratoria. [1] Estos cortes se utilizan para estudiar diversos aspectos de la fisiología, patología y farmacología pulmonar, lo que proporciona a los investigadores una herramienta valiosa para investigar enfermedades pulmonares y probar los efectos de los medicamentos en el tejido pulmonar. [2]
Los cortes de pulmón con precisión se preparan utilizando equipos especializados llamados vibratomos , lo que garantiza que el tejido permanezca viable y conserve sus características estructurales y funcionales, lo que los hace ideales para una amplia gama de aplicaciones experimentales. [3] [4]
Dr. Ricardo Pineda, Universidad de Pittsburgh. Corte de pulmón de ratón cortado con precisión (PCLS; 300 μm) teñido para colágeno y fibronectina. Realizado con un vibratomo.
Historia
La historia de los cortes de pulmón de precisión (PCLS) se remonta a la década de 1920, cuando los científicos exploraron por primera vez los cortes de tejido para estudiar el metabolismo y la toxicología de los órganos. Inicialmente, el corte manual de tejidos, como el hígado, generó una variabilidad significativa en el grosor y una viabilidad limitada. [5]
En la década de 1940 se produjo un avance decisivo cuando Stadie y Riggs introdujeron un micrótomo equipado con una hoja de afeitar fina, que reducía la variabilidad del espesor a aproximadamente el 5 %. Estos cortes mejorados pasaron a conocerse como cortes de tejido de corte de precisión. [6]
La creación de PCLS planteó desafíos únicos debido a la intrincada estructura del pulmón. En la década de 1980, Placke y Fisher lograron un gran avance al infundir agarosa líquida calentada en las vías respiratorias de los pulmones de hámster y rata, lo que impidió el colapso de las vías respiratorias y los alveolos durante el corte. [6]
Preparación básica
La creación de cortes de pulmón de precisión (PCLS, por sus siglas en inglés) es un proceso meticuloso que implica varios pasos esenciales. El uso de vibratomos es crucial para garantizar la producción de cortes de pulmón precisos y de alta calidad para fines de investigación. [7]
Uso de vibratomos
A. Preparación de tejido pulmonar en un portamuestras. B. Configuración para obtener cortes. C. Generación de cortes de pulmón cortados con precisión utilizando un vibratomo.
Los pasos básicos involucrados en la preparación de PCLS utilizando vibratomos incluyen: [8]
Selección de tejidos
Comience seleccionando cuidadosamente el tejido pulmonar de las especies deseadas, como roedores o humanos, asegurándose de que el tejido sea de alta calidad y saludable.
Inclusión de tejidos
Para facilitar el corte y mantener la estructura del tejido, el tejido pulmonar normalmente se incrusta en un medio adecuado, como agarosa o gelatina, en el portamuestras del vibratomo.
Proceso de corte
El vibratomo funciona haciendo oscilar una cuchilla vertical u horizontalmente a altas frecuencias mientras el tejido está sumergido en una solución de corte. Esta oscilación mecánica crea cortes finos y precisos de tejido pulmonar. Los investigadores pueden ajustar los parámetros de corte, como el grosor del corte, para cumplir con requisitos experimentales específicos. Por lo general, los PCLS tienen grosores que van desde 200 a 500 μm.
Posprocesamiento
Dependiendo de los objetivos de la investigación, los PCLS pueden sufrir pasos adicionales como lavado, cultivo o tratamiento con sustancias de interés, como medicamentos o estímulos.
Mantenimiento de PCLS
Garantizar la viabilidad de los cortes de pulmón cortados con precisión (PCLS) durante el mantenimiento ex vivo presenta varios desafíos. Por lo general, los PCLS se sumergen en un medio de cultivo dentro de placas de múltiples pocillos, simulando las condiciones de cultivo de tejidos a 37 °C, 5 % de CO2 y 95-100 % de humedad del aire. [9] El medio de cultivo se renueva diariamente y se optimiza con nutrientes esenciales, lo que permite mantener viables los PCLS hasta 14 días, una mejora significativa en comparación con informes anteriores de solo 3-5 días. [10] Además, la inclusión de antibióticos como la penicilina y la estreptomicina ayuda a prevenir la contaminación por patógenos desde el comienzo del cultivo. [11]
Durante el cultivo, las PCLS conservan su viabilidad, actividad metabólica normal, integridad tisular y capacidad de respuesta a estímulos como el lipopolisacárido (LPS). [10] Sin embargo, es importante señalar que los períodos de cultivo prolongados pueden provocar algunos cambios en la función de las PCLS. Por ejemplo, aunque las PCLS humanas pueden contraerse en respuesta a la metacolina, la secreción de TNF-α inducida por LPS, aunque se mantiene, puede disminuir con el tiempo. [12] Además, el cultivo a largo plazo puede provocar la pérdida de ciertas poblaciones celulares, como neumocitos y linfocitos, así como la degradación de las fibras de tejido conectivo. Estos cambios pueden contribuir a la disminución de la sensibilidad de las PCLS cultivadas a los estímulos externos. [12]
En la práctica, los PCLS pueden mantener una viabilidad y una homeostasis tisular comparables durante 1 a 3 días, aunque se pueden lograr períodos más prolongados con condiciones de cultivo optimizadas. [13]
Aplicaciones experimentales
Los cortes de pulmón de precisión se utilizan ampliamente en diversas aplicaciones experimentales en el campo de la investigación respiratoria. Algunas de las áreas clave en las que se utilizan los PCLS incluyen:
Asma
En su afán por comprender y desarrollar tratamientos para el asma, los investigadores han explorado diversos modelos, incluidos modelos animales como ratones y ratas, para imitar diferentes aspectos de la enfermedad. Si bien estos modelos animales han contribuido a nuestro conocimiento, tienen limitaciones, en particular en términos de su aplicabilidad a los seres humanos. [14]
Para abordar estas limitaciones y mejorar nuestra comprensión del asma, los investigadores han recurrido a cortes de pulmón humanos cortados con precisión (PCLS) obtenidos de individuos sanos y enfermos como una valiosa herramienta ex vivo. [15] Los PCLS derivados de pulmones sanos y asmáticos exhiben respuestas alteradas a varios estímulos, incluida la broncoconstricción y la hiperreactividad, que se parecen mucho a las observadas en pacientes y varios modelos animales. [15]
Además, se ha demostrado que las PCLS de individuos con asma muestran una inflamación de las vías respiratorias significativamente mayor y una hiperreactividad cuando son estimuladas por factores como el rinovirus. [16] Estas PCLS también muestran una expresión genética elevada relacionada con la patogénesis del asma, incluidos genes como Il25, Tslp e Il13. [17] Estos hallazgos coinciden con las observaciones en pacientes asmáticos, lo que indica que los modelos de PCLS proporcionan una plataforma prometedora para la investigación del asma. [15]
EPOC (Enfermedad Pulmonar Obstructiva Crónica)
Si bien no existen modelos in vivo que abarquen todos los aspectos de la patología clínica de la EPOC, ciertos modelos animales, como los que implican la exposición al humo del cigarrillo, el enfisema inducido por elastasa y la exposición a LPS, han proporcionado información valiosa. Por ejemplo, la exposición de cobayas o ratones al humo del cigarrillo puede reproducir características clave de la EPOC humana, incluido el enfisema, la remodelación de las vías respiratorias pequeñas y la hipertensión pulmonar. Sin embargo, este modelo generalmente manifiesta un enfisema leve y requiere meses para desarrollarse. [18] Por el contrario, la administración de elastasa a los pulmones de ratones induce rápidamente un fenotipo enfisematoso, lo que permite controlar la gravedad de la enfermedad ajustando la dosis de elastasa, la vía de administración y la duración. [19] Vale la pena señalar que la relevancia fisiológica de los modelos de elastasa y LPS es discutible debido a las diferencias en los mecanismos subyacentes. [20]
El uso de cortes de pulmón de precisión (PCLS) de modelos in vivo ha demostrado ser particularmente valioso para modelar la EPOC. Por ejemplo, los PCLS obtenidos de ratones expuestos al humo han mostrado una expresión elevada de quimiocinas cuando se los estimula con imitadores virales o el virus de la influenza A. [21] Los PCLS murinos también han demostrado que la infección por influenza A y el humo del cigarrillo pueden afectar la respuesta broncodilatadora a los agonistas de los receptores β2-adrenérgicos. Los estudios futuros que empleen PCLS de pacientes con EPOC tienen el potencial de permitir la caracterización funcional y fenotípica de las células inmunitarias, lo que facilitaría una comprensión más integral de los mecanismos moleculares que subyacen a la heterogeneidad de la enfermedad.
Fibrosis pulmonar idiopática (FPI)
Los cortes de pulmón de precisión (PCLS) han demostrado ser eficaces para estudiar las primeras etapas de la fibrosis pulmonar en la FPI. Cuando se expusieron a TGF-β1 y cloruro de cadmio, los PCLS humanos y de rata mostraron cambios patohistológicos relevantes que se observan comúnmente en las primeras fases de la fibrosis pulmonar. Estos cambios incluyen la regulación positiva de genes profibróticos críticos, un mayor grosor de los tabiques alveolares y una activación anormal de las células pulmonares. [22]
Los recientes avances en la investigación han llevado al establecimiento de un modelo ex vivo de PCLS humano enfocado específicamente en la fibrosis en etapa temprana. Este modelo implica exponer a los PCLS a una combinación de factores de crecimiento profibróticos y moléculas de señalización, incluidos TGF-β1, TNF-α, factor de crecimiento derivado de plaquetas-AB y ácido lisofosfatídico. [23] Este enfoque ofrece una vía para investigar los mecanismos subyacentes de la FPI temprana y evaluar terapias novedosas. [24]
Los investigadores están evaluando activamente nuevos tratamientos para la FPI utilizando PCLS. Por ejemplo, la cafeína, que inhibe los aumentos inducidos por TGF-β en la expresión de genes profibróticos, ha demostrado ser prometedora al reducir significativamente la fibrosis en PCLS de ratones tratados con bleomicina. Además, la señalización dirigida a PI3K ha surgido como una estrategia de tratamiento antifibrótico prometedora, como se demostró utilizando PCLS derivados de pacientes con FPI. [24]
El uso de PCLS en la investigación de la FPI tiene un gran potencial para comprender las primeras etapas de la enfermedad, probar terapias innovadoras y descubrir nuevas estrategias de tratamiento.
Infección e inflamación
Los cortes de pulmón de precisión (PCLS) han sido fundamentales para estudiar las respuestas innatas del cuerpo a los desafíos virales y, en menor medida, bacterianos. Este sistema ha arrojado luz sobre qué células se infectan dentro del pulmón intacto, ofreciendo información distinta a la de los cultivos de interfase aire-líquido in vitro. [25]
Los estudios de Goris et al. han revelado variaciones en la infectividad de diferentes tipos de células dentro del pulmón. Por ejemplo, la infección por el virus de la parainfluenza bovina se observó principalmente en células debajo del epitelio pulmonar dentro del sistema PCLS. [26] [27] Es importante destacar que esto sugiere que el epitelio, cuando se encuentra en su estructura fisiológica natural, resiste la infección. Kirchhoff et al. informaron hallazgos similares. [28] Estos estudios enfatizan la importancia de estudiar las células dentro de su entorno fisiológico, considerando las asociaciones celulares y la arquitectura estructural. Tales interacciones no solo afectan la infectividad sino que también dan forma a la respuesta del sistema a la infección.
El sistema PCLS es una herramienta valiosa para comprender las respuestas inflamatorias. Se ha empleado para investigar la respuesta innata a los componentes de la pared bacteriana, como el LPS, y para realizar estudios complejos de infecciones mixtas que involucran múltiples virus o coinfecciones virales y bacterianas. Este enfoque permite un análisis preciso de las respuestas inmunitarias a cada estímulo. En modelos más simples, el PCLS se ha utilizado para evaluar el impacto del LPS en la respuesta inmunitaria innata, probando los efectos de varios inmunomoduladores en la señalización innata. [29] [23]
Además, la capacidad de obtener cortes de pulmones enfermos, como los afectados por enfermedades como la EPOC y el asma, proporciona un modelo sólido para estudiar cómo las enfermedades respiratorias influyen en la infectividad y las respuestas del huésped. Esto es particularmente relevante para enfermedades como la EPOC y el asma, que tienen vínculos con exacerbaciones inducidas por patógenos.
La investigación del PCLS en infecciones e inflamación mejora nuestra comprensión de las respuestas inmunes, allanando el camino para obtener más información sobre los mecanismos de la enfermedad y posibles estrategias terapéuticas.
Prueba de drogas
Los cortes de pulmón de precisión (PCLS, por sus siglas en inglés) desempeñan un papel crucial en la evaluación de nuevos objetivos terapéuticos para el asma, especialmente a medida que se vuelve más común la tolerancia a los tratamientos convencionales, como los glucocorticoides y los agonistas del receptor β2. Los investigadores se han centrado cada vez más en objetivos relevantes para la patogénesis del asma, y los PCLS se han convertido en una herramienta valiosa para evaluar estos objetivos como posibles terapias. [30]
Por ejemplo, los estudios han demostrado que la inhibición de la histona desacetilasa con tricostatina A puede aliviar la constricción de las vías respiratorias en PCLS humanos y reducir simultáneamente la hiperreactividad de las vías respiratorias en ratones expuestos a antígenos. [31] Además, se ha descubierto que la activación de la guanilato ciclasa soluble en el músculo liso de las vías respiratorias utilizando análogos de riociguat y cinaciguat induce broncodilatación en PCLS humanos normales y revierte la hiperreactividad de las vías respiratorias en ratones asmáticos alérgicos, restaurando la función pulmonar normal. [30] [32]
El uso de PCLS en el desarrollo de fármacos se está expandiendo aún más, con agonistas o inhibidores específicos dirigidos a los receptores de sabor amargo, el receptor activado por el proliferador de peroxisomas (PPAR) γ, la fosfoinosítido-3 quinasa (PI3K), los canales BK y la tirosina quinasa del bazo (Syk), todos ellos en investigación dentro de este contexto. [30] [33]
La investigación sobre PCLS contribuye significativamente al desarrollo de estrategias terapéuticas innovadoras para el asma, abordando los desafíos cambiantes de la resistencia al tratamiento. [30]
Ventajas de PCLS
Los cortes de pulmón cortados con precisión (PCLS, por sus siglas en inglés) ofrecen varias ventajas distintivas que los convierten en herramientas invaluables en la investigación respiratoria. Se destacan por preservar la intrincada arquitectura pulmonar, manteniendo las estructuras esenciales de los tejidos como las vías respiratorias pequeñas, el parénquima respiratorio, las poblaciones de células estructurales e inmunitarias y el tejido conectivo. [34] La composición celular dentro de los PCLS refleja de cerca la de los pulmones intactos, conservando la organización de las células estructurales e inmunitarias. [35] [36] Sin embargo, es importante señalar que la distribución de tipos específicos de células puede variar entre cortes debido a la variabilidad regional dentro del pulmón, especialmente en presencia de cambios no uniformes relacionados con la enfermedad. [37]
En ciertos contextos, los PCLS pueden considerarse como "minipulmones". [38] Si bien carecen de un sistema inmunitario reclutable, los PCLS brindan una oportunidad única de correlacionar las funciones específicas de las células con la fisiología de los órganos. Presentan respuestas complejas a desafíos y estímulos, como la contracción de las vías respiratorias y las respuestas inmunitarias, lo que arroja luz sobre los mecanismos de la enfermedad y las evaluaciones del tratamiento. [39]
Los PCLS se han utilizado en una amplia gama de áreas de investigación respiratoria, como asma, EPOC, fibrosis pulmonar idiopática, alergias, infecciones y estudios toxicológicos. Los investigadores han aprovechado las ventajas de los PCLS para modelar y estudiar estas enfermedades respiratorias importantes, lo que facilita la comprensión y la relevancia translacional para las enfermedades humanas. [37]
Limitaciones del PCLS
Los cortes de pulmón de precisión (PCLS, por sus siglas en inglés) brindan información valiosa sobre la fisiología y patología pulmonar, pero tienen limitaciones. En primer lugar, los PCLS representan una "instantánea" estática del tejido pulmonar en el momento de la escisión, sin acceso al sistema inmunológico dinámico y reclutable presente en los organismos vivos. Esta limitación dificulta la comprensión completa de las respuestas inmunológicas dentro del pulmón. [40]
Además, el tejido pulmonar es inherentemente heterogéneo, con variaciones en la integridad epitelial, las poblaciones de células inmunitarias y las respuestas a la estimulación en las diferentes regiones pulmonares. Al estudiar enfermedades, como las afecciones respiratorias, esta heterogeneidad puede complicar la interpretación de los datos, lo que requiere un análisis estadístico cuidadoso para tener en cuenta la variabilidad entre cortes. [41] [42]
Las PCLS tienen una capacidad limitada para replicar por completo las complejas y dinámicas respuestas inmunitarias observadas en los organismos vivos. No pueden reclutar células inmunitarias no residentes y su viabilidad está restringida a aproximadamente dos semanas. [43] Si bien pueden capturar señales iniciales inducidas por patógenos, no pueden imitar por completo las complejas respuestas inmunitarias observadas en un pulmón vivo. [44]
Otra limitación es que los PCLS se utilizan normalmente como sistemas estáticos y no replican el movimiento respiratorio natural del pulmón. [45] Esto es particularmente relevante cuando se estudian enfermedades como la lesión pulmonar inducida por el respirador, donde el estrés mecánico de la ventilación juega un papel crucial. Se han hecho intentos de estirar o deformar los PCLS para simular la dinámica mecánica, pero replicar con precisión estos procesos sigue siendo un desafío. [46] [47] [48]
La administración de tratamientos en el PCLS puede ser un desafío porque todo el corte está bañado en el compuesto o estimulante de interés. Esto plantea dificultades para trasladar los hallazgos a aplicaciones inhaladas o sistémicas in vivo, lo que dificulta la dosificación y la traducción [49]
La administración de tratamientos en pacientes con PCLS puede ser un desafío porque todo el corte está bañado en el compuesto o estimulante de interés. Esto plantea dificultades para trasladar los hallazgos a aplicaciones inhalatorias o sistémicas in vivo, lo que hace que la dosificación y la traducción sean complejas. [48] [50]
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