En microscopía de fluorescencia , la colocalización se refiere a la observación de la superposición espacial entre dos (o más) marcadores fluorescentes diferentes, cada uno con una longitud de onda de emisión separada, para ver si los diferentes "objetivos" están ubicados en la misma área de la célula o muy cerca uno del otro. La definición se puede dividir en dos fenómenos diferentes, la coocurrencia, que se refiere a la presencia de dos fluoróforos (posiblemente no relacionados) en el mismo píxel, y la correlación, una relación estadística mucho más significativa entre los fluoróforos indicativa de una interacción biológica. [1] Esta técnica es importante para muchos estudios biológicos y fisiológicos celulares durante la demostración de una relación entre pares de biomoléculas.
La capacidad de demostrar una correlación entre un par de biomoléculas fue mejorada en gran medida por Erik Manders de la Universidad de Ámsterdam, quien introdujo el coeficiente de correlación de Pearson (PCC) a los microscopistas, [2] junto con otros coeficientes de los cuales los "coeficientes de superposición" M1 y M2 han demostrado ser los más populares y útiles. [3] [4] El propósito de usar coeficientes es caracterizar el grado de superposición entre imágenes, generalmente dos canales en una imagen de microscopía multidimensional registrada en diferentes longitudes de onda de emisión. Un enfoque popular fue introducido por Sylvain Costes, quien utilizó el coeficiente de correlación de Pearson como una herramienta para establecer los umbrales requeridos por M1 y M2 de una manera objetiva. [5] El enfoque de Costes asume que solo las correlaciones positivas son de interés y no proporciona una medición útil del PCC.
Aunque el uso de coeficientes puede mejorar significativamente la fiabilidad de la detección de colocalización, depende de varios factores, incluidas las condiciones de preparación de las muestras con fluorescencia y de la adquisición y procesamiento de las imágenes con colocalización. Los estudios deben realizarse con gran cautela y después de una lectura cuidadosa de los antecedentes. Actualmente, el campo está plagado de confusión y aún no se ha establecido firmemente un enfoque estandarizado. [6] Los intentos de rectificar esto incluyen la reexaminación y revisión de algunos de los coeficientes, [7] [8] la aplicación de un factor para corregir el ruido, [1] "Replica based noise corrected correlations for accurate measurement of colocalization" [9] y la propuesta de protocolos adicionales, [10] que fueron revisados exhaustivamente por Bolte y Cordelieres (2006). [6] Además, debido a la tendencia de las imágenes de fluorescencia a contener una cierta cantidad de señal desenfocada, ruido de poisson y otros ruidos, generalmente requieren un preprocesamiento antes de la cuantificación. [11] [12] La restauración cuidadosa de imágenes mediante deconvolución elimina el ruido y aumenta el contraste en las imágenes, mejorando la calidad de los resultados del análisis de colocalización. Hasta ahora, los métodos más utilizados para cuantificar la colocalización calculan la correlación estadística de las intensidades de píxeles en dos canales de microscopía distintos. Estudios más recientes han demostrado que esto puede conducir a coeficientes de correlación altos incluso para objetivos que se sabe que residen en diferentes compartimentos celulares. [13] Se puede lograr una cuantificación más robusta de la colocalización combinando el reconocimiento digital de objetos, el cálculo de la superposición del área y la combinación con un valor de correlación de intensidad de píxeles. Esto condujo al concepto de un coeficiente de correlación de Pearson corregido por objeto. [13]
Algunos colorantes fluorescentes impermeables de zinc pueden marcar de forma detectable el citosol y los núcleos de las células apoptizantes y necrotizantes entre cada uno de los cuatro tipos de tejidos diferentes examinados. A saber: la corteza cerebral , el hipocampo , el cerebelo , y también se demostró que la detección colocalizada del aumento de zinc y el indicador de muerte celular bien aceptado, el yoduro de propidio, también se produjo en las células renales. Utilizando los principios de la colocalización fluorescente, se demostró la detección coincidente de la acumulación de zinc y la captación de yoduro de propidio (un indicador tradicional de muerte celular) en múltiples tipos de células. [14] Se pueden encontrar varios ejemplos de cuantificación de la colocalización en el campo de la neurociencia en una revisión. [15] Se pueden encontrar protocolos detallados sobre la cuantificación de la colocalización en un capítulo de libro. [16]
La colocalización se utiliza en la microscopía de fluorescencia de moléculas individuales en tiempo real para detectar interacciones entre especies moleculares marcadas con fluorescencia. En este caso, una especie (por ejemplo, una molécula de ADN) normalmente se inmoviliza en la superficie de la imagen y la otra especie (por ejemplo, una proteína de unión al ADN) se suministra a la solución. Las dos especies se marcan con colorantes de colores con resolución espectral (>50 nm), por ejemplo, cianina-3 y cianina-5. La excitación de la fluorescencia se lleva a cabo normalmente en modo de reflexión interna total, lo que aumenta la relación señal-ruido de las moléculas en la superficie con respecto a las moléculas en la solución a granel. Las moléculas se detectan como puntos que aparecen en la superficie en tiempo real y sus ubicaciones se encuentran con una precisión de entre 10 y 20 nm mediante el ajuste de funciones de dispersión de puntos. Dado que los tamaños típicos de las biomoléculas son del orden de 10 nm, esta precisión suele ser suficiente para determinar las interacciones moleculares [17].
Con el propósito de interpretar mejor los resultados de los estudios cualitativos y cuantitativos de colocalización, se sugirió utilizar un conjunto de cinco variables lingüísticas vinculadas a los valores de los coeficientes de colocalización, como muy débil , débil , moderada , fuerte y muy fuerte , para describirlos. El enfoque se basa en el uso del modelo de sistema difuso y simulación por computadora. Cuando se introducen nuevos coeficientes, sus valores se pueden ajustar al conjunto. [18]
El grado de colocalización en imágenes de microscopía de fluorescencia se puede validar utilizando Colocalization Benchmark Source , una colección gratuita de conjuntos de imágenes descargables con valores de colocalización predefinidos.