La citogenética molecular combina dos disciplinas, la biología molecular y la citogenética , e implica el análisis de la estructura cromosómica para ayudar a distinguir las células normales de las cancerígenas. La citogenética humana comenzó en 1956 cuando se descubrió que las células humanas normales contienen 46 cromosomas. Sin embargo, las primeras observaciones microscópicas de cromosomas fueron reportadas por Arnold, Flemming y Hansemann a fines del siglo XIX. Su trabajo fue ignorado durante décadas hasta que se descubrió que el número real de cromosomas en humanos era 46. En 1879, Arnold examinó células de sarcoma y carcinoma que tenían núcleos muy grandes. Hoy, el estudio de la citogenética molecular puede ser útil para diagnosticar y tratar varias neoplasias malignas, como neoplasias hematológicas, tumores cerebrales y otros precursores del cáncer. El campo se centra en general en el estudio de la evolución de los cromosomas, más específicamente el número, la estructura, la función y el origen de las anomalías cromosómicas. [1] [2] Incluye una serie de técnicas denominadas hibridación in situ fluorescente o FISH, en las que las sondas de ADN se marcan con etiquetas fluorescentes de diferentes colores para visualizar una o más regiones específicas del genoma. Introducida en la década de 1980, la FISH utiliza sondas con secuencias de bases complementarias para localizar la presencia o ausencia de regiones específicas de ADN. La FISH se puede realizar como un enfoque directo a los cromosomas en metafase o a los núcleos en interfase. Alternativamente, se puede adoptar un enfoque indirecto en el que se puede evaluar todo el genoma en busca de cambios en el número de copias utilizando cariotipos virtuales. Los cariotipos virtuales se generan a partir de matrices formadas por miles o millones de sondas, y se utilizan herramientas computacionales para recrear el genoma in silico .
La hibridación in situ con fluorescencia mapea secuencias de ADN de una sola copia o repetitivas a través del etiquetado de localización de ácidos nucleicos específicos. La técnica utiliza diferentes sondas de ADN marcadas con etiquetas fluorescentes que se unen a una o más regiones específicas del genoma. [3] Etiqueta todos los cromosomas individuales en cada etapa de la división celular para mostrar anomalías estructurales y numéricas que pueden surgir a lo largo del ciclo. Esto se hace con una sonda que puede ser específica de locus, centromérica, telomérica y cromosómica completa. Esta técnica se realiza típicamente en células en interfase y tejidos de bloque de parafina. La hibridación in situ con fluorescencia mapea secuencias de ADN de una sola copia o repetitivas a través del etiquetado de localización de ácidos nucleicos específicos. La técnica utiliza diferentes sondas de ADN marcadas con etiquetas fluorescentes que se unen a una o más regiones específicas del genoma. Las señales de las etiquetas fluorescentes se pueden ver con microscopía , y las mutaciones se pueden ver comparando estas señales con células sanas. Para que esto funcione, el ADN debe desnaturalizarse usando calor o productos químicos para romper los enlaces de hidrógeno; esto permite que se produzca la hibridación una vez que se mezclan dos muestras. Las sondas fluorescentes crean nuevos enlaces de hidrógeno, reparando así el ADN con sus bases complementarias, lo que puede detectarse mediante microscopía. La hibridación in situ con fluorescencia permite visualizar diferentes partes del cromosoma en diferentes etapas del ciclo celular. La hibridación in situ con fluorescencia se puede realizar como un enfoque directo a los cromosomas en metafase o a los núcleos en interfase. Alternativamente, se puede adoptar un enfoque indirecto en el que se puede evaluar todo el genoma para detectar cambios en el número de copias mediante cariotipos virtuales. Los cariotipos virtuales se generan a partir de microarreglos formados por miles o millones de sondas, y se utilizan herramientas computacionales para recrear el genoma in silico . [4]
La hibridación genómica comparativa (CGH), derivada de la hibridación in situ con fluorescencia (FISH), se utiliza para comparar las variaciones en el número de copias entre una muestra biológica y una referencia. La CGH se desarrolló originalmente para observar aberraciones cromosómicas en células tumorales. Este método utiliza dos genomas, una muestra y un control, que se marcan con fluorescencia para distinguirlos. [5] En la CGH, se aísla el ADN de una muestra tumoral y se le adhiere biotina. Otra proteína marcadora, la digoxigenina, se une a la muestra de ADN de referencia. [6] Las muestras de ADN marcadas se cohibridan con sondas durante la división celular, que es el momento más informativo para observar la variación del número de copias. [7] La CGH crea un mapa que muestra la abundancia relativa de ADN y el número de cromosomas. Al comparar la fluorescencia de una muestra con una referencia, la CGH puede señalar ganancias o pérdidas de regiones cromosómicas. [6] [8] La CGH se diferencia de la FISH porque no requiere un objetivo específico ni conocimiento previo de la región genética que se está analizando. La CGH también puede analizar un genoma completo con relativa rapidez para detectar diversos desequilibrios cromosómicos, lo que resulta útil en pacientes con problemas genéticos subyacentes y cuando no se conoce un diagnóstico oficial. Esto suele ocurrir con los cánceres hematológicos.
La hibridación genómica comparativa de matriz (aCGH) permite realizar la CGH sin cultivo celular ni aislamiento. En su lugar, se realiza en portaobjetos de vidrio que contienen pequeños fragmentos de ADN. [9] La eliminación del paso de cultivo celular y aislamiento simplifica y acelera drásticamente el proceso. Utilizando principios similares a la CGH, el ADN de muestra se aísla y se marca con fluorescencia, luego se cohibrida con sondas monocatenarias para generar señales. Se pueden detectar miles de estas señales a la vez, y este proceso se conoce como detección paralela. [10] Se miden las relaciones de fluorescencia entre las señales de muestra y de referencia, que representan la diferencia promedio entre la cantidad de cada una. Esto mostrará si hay más o menos ADN de muestra de lo esperado por referencia.
La hibridación in situ de cromosomas mediante FISH permite estudiar la citogenética en muestras prenatales y posnatales y también se utiliza ampliamente en pruebas citogenéticas para el cáncer. Mientras que la citogenética es el estudio de los cromosomas y su estructura, las pruebas citogenéticas implican el análisis de células en la sangre, tejido, médula ósea o líquido para identificar cambios en los cromosomas de un individuo. Esto se hacía a menudo mediante el cariotipo y ahora se hace con FISH. Este método se utiliza comúnmente para detectar deleciones o translocaciones cromosómicas a menudo asociadas con el cáncer. La FISH también se utiliza para lesiones melanocíticas, distinguiendo el melanoma melanocítico atípico del maligno. [5]
Las células cancerosas suelen acumular cambios estructurales cromosómicos complejos, como pérdida, duplicación, inversión o movimiento de un segmento. [11] Cuando se utiliza la hibridación in situ con fluorescencia, cualquier cambio en un cromosoma se hará visible a través de discrepancias entre los cromosomas cancerosos marcados con fluorescencia y los cromosomas sanos. [11] Los hallazgos de estos experimentos citogenéticos pueden arrojar luz sobre las causas genéticas del cáncer y pueden localizar posibles dianas terapéuticas. [12]
La citogenética molecular también puede utilizarse como herramienta diagnóstica para síndromes congénitos en los que se desconocen las causas genéticas subyacentes de la enfermedad. [13] El análisis de la estructura cromosómica de un paciente puede revelar cambios causales. Los nuevos métodos de biología molecular desarrollados en las últimas dos décadas, como la secuenciación de nueva generación y la secuenciación de ARN, han reemplazado en gran medida a la citogenética molecular en el diagnóstico, pero recientemente el uso de derivados de la hibridación in situ con fluorescencia (FISH), como la hibridación in situ con fluorescencia multicolor y la hibridación in situ con bandas multicolores (mBAND), ha ido en aumento en aplicaciones médicas. [14]
Uno de los proyectos actuales relacionados con la citogenética molecular implica la investigación genómica sobre cánceres raros, llamada Iniciativa de Caracterización del Genoma del Cáncer (CGCI). [15] La CGCI es un grupo interesado en describir las anomalías genéticas de algunos cánceres raros, empleando la secuenciación avanzada de genomas, exomas y transcriptomas, que en última instancia pueden desempeñar un papel en la patogénesis del cáncer. [15] Actualmente, la CGCI ha dilucidado algunas alteraciones genéticas previamente indeterminadas en el meduloblastoma y el linfoma no Hodgkin de células B. Los próximos pasos para la CGCI son identificar alteraciones genómicas en tumores VIH+ y en el linfoma de Burkitt .
Algunas técnicas de secuenciación de alto rendimiento que utiliza el CGCI incluyen: secuenciación del genoma completo , secuenciación del transcriptoma , secuenciación ChIP y Illumina Infinum MethylationEPIC BeadCHIP. [16]