ChIP-exo es un método basado en inmunoprecipitación de cromatina para mapear las ubicaciones en las que una proteína de interés ( factor de transcripción ) se une al genoma. Es una modificación del protocolo ChIP-seq , que mejora la resolución de los sitios de unión de cientos de pares de bases a casi un par de bases. Emplea el uso de exonucleasas para degradar hebras del ADN unido a la proteína en la dirección 5'-3' hasta una pequeña cantidad de nucleótidos del sitio de unión de la proteína. Los nucleótidos de los extremos tratados con exonucleasa se determinan utilizando alguna combinación de secuenciación de ADN , microarreglos y PCR . Luego, estas secuencias se mapean al genoma para identificar las ubicaciones en el genoma en las que se une la proteína.
Las técnicas de inmunoprecipitación de cromatina ( ChIP ) se han utilizado desde 1984 [1] para detectar interacciones proteína-ADN. Ha habido muchas variaciones en ChIP para mejorar la calidad de los resultados. Una de esas mejoras, ChIP-on-chip (ChIP-chip), combina ChIP con tecnología de microarrays. Esta técnica tiene una sensibilidad y especificidad limitadas, especialmente in vivo donde los microarrays están restringidos por miles de proteínas presentes en el compartimento nuclear, lo que resulta en una alta tasa de falsos positivos. [2] Luego vino la secuenciación ChIP (ChIP-seq), que combina ChIP con secuenciación de alto rendimiento. [3] Sin embargo, la naturaleza heterogénea de los fragmentos de ADN cortados mapea los sitios de unión con una precisión de ±300 pares de bases, lo que limita la especificidad. En segundo lugar, el ADN contaminante presenta un grave problema ya que muy pocos loci genéticos están entrecruzados con la proteína de interés, lo que hace que cualquier ADN genómico no específico sea una fuente significativa de ruido de fondo. [4]
Para abordar estos problemas, Rhee y Pugh revisaron el ensayo clásico de protección de nucleasas para desarrollar ChIP-exo. [5] Esta nueva técnica de ChIP se basa en una exonucleasa lambda que degrada solo, y todo, el ADN bicatenario no unido en la dirección 5'-3'. Brevemente, una proteína de interés (diseñar una con una etiqueta de epítopo puede ser útil para la inmunoprecipitación) se reticula in vivo a sus ubicaciones de unión naturales a lo largo de un genoma utilizando formaldehído.
Las células se recogen, se abren y la cromatina se corta y se solubiliza mediante sonicación . A continuación, se utiliza un anticuerpo para inmunoprecipitar la proteína de interés, junto con el ADN reticulado. A continuación, se ligan los adaptadores de PCR de ADN a los extremos, que sirven como punto de cebado para la síntesis de ADN de segunda cadena después de la digestión con exonucleasa. A continuación, la exonucleasa lambda digiere las cadenas dobles de ADN desde el extremo 5' hasta que la digestión se bloquea en el borde de la interacción covalente proteína-ADN. La mayor parte del ADN contaminante se degrada mediante la adición de una segunda exonucleasa específica de cadena sencilla. Después de que se revierte la reticulación , los cebadores de los adaptadores de PCR se extienden para formar ADN de doble cadena, y se liga un segundo adaptador a los extremos 5' para demarcar la ubicación precisa del cese de la digestión con exonucleasa. A continuación, la biblioteca se amplifica mediante PCR y los productos se identifican mediante secuenciación de alto rendimiento . Este método permite la resolución de hasta un solo par de bases para cualquier sitio de unión de proteínas dentro de cualquier genoma, lo que supone una resolución mucho mayor que la de ChIP-chip o ChIP-seq.
Se ha demostrado que ChIP-exo permite identificar los sitios de unión de proteínas con una resolución de hasta un solo par de bases, a diferencia de ChIP-seq, que puede localizar el sitio de unión de una proteína con solo ±300 pares de bases. [4]
La contaminación de fragmentos de ADN no unidos a proteínas puede dar lugar a una alta tasa de falsos positivos y negativos en los experimentos de ChIP. La adición de exonucleasas al proceso no solo mejora la resolución de la determinación del sitio de unión, sino que también elimina el ADN contaminante de la solución antes de la secuenciación. [4]
Las proteínas que no se unen de manera eficaz a un fragmento de nucleótido tienen más probabilidades de ser detectadas por ChIP-exo. Esto ha permitido, por ejemplo, el reconocimiento de más sitios de unión del factor de transcripción CTCF de los que se habían descubierto anteriormente. [5]
Debido a la mayor resolución y al fondo reducido, se necesita una menor profundidad de cobertura de secuenciación cuando se utiliza ChIP-exo. [4]
Si un complejo proteína-ADN tiene múltiples lugares de reticulación dentro de un único evento de unión, puede parecer que hay múltiples eventos de unión distintos. Esto probablemente se debe a que estas proteínas se desnaturalizan y se reticulan en uno de los sitios de unión disponibles dentro del mismo evento. La exonucleasa se detendría entonces en uno de los sitios de unión, dependiendo de a qué sitio se reticula la proteína. [5]
Como ocurre con cualquier método basado en ChIP, es necesario disponer de un anticuerpo adecuado para la proteína de interés para poder utilizar esta técnica.
Rhee y Pugh presentan ChIP-exo realizando análisis en una pequeña colección de factores de transcripción: Reb1, Gal4, Phd1, Rap1 en levadura y CTCF en humanos. Los sitios Reb1 se encontraron a menudo en grupos y estos grupos tenían una ocupación ~10 veces mayor de lo esperado. Los sitios secundarios en los grupos se encontraron a ~40 pb de un sitio de unión primario. Los motivos de unión de Gal4 mostraron una fuerte preferencia por tres de los cuatro nucleótidos, lo que sugiere una interacción negativa entre Gal4 y el nucleótido excluido. Phd1 reconoce tres motivos diferentes, lo que explica informes previos de la ambigüedad del motivo de unión de Phd1. Se encontró que Rap1 reconocía cuatro motivos.
Los genes de las proteínas ribosomales unidos por esta proteína tenían una tendencia a utilizar un motivo particular con una secuencia de consenso más fuerte. Otros genes solían utilizar grupos de motivos de consenso más débiles, posiblemente para lograr una ocupación similar. Los motivos de unión de CTCF empleaban cuatro "módulos". La mitad de los sitios CTCF unidos utilizaban los módulos 1 y 2, mientras que el resto utilizaba alguna combinación de los cuatro. Se cree que CTCF utiliza sus dedos de zinc para reconocer diferentes combinaciones de estos módulos. [5]
Rhee y Pugh analizaron la estructura y la organización del complejo de preiniciación (PIC) en genomas de Saccharomyces . Mediante ChIP-exo, pudieron, entre otros descubrimientos, identificar con precisión características similares a TATA en promotores que se informó que carecían de TATA. [6]