El aislamiento celular es el proceso de separar células vivas individuales de un bloque sólido de tejido o suspensión celular. Si bien algunos tipos de células existen naturalmente en una forma separada (por ejemplo, las células sanguíneas ), otros tipos de células que se encuentran en tejido sólido requieren técnicas específicas para separarlas en células individuales. Esto se puede realizar mediante el uso de enzimas para digerir las proteínas que unen a estas células dentro de la matriz extracelular . Después de que las proteínas de la matriz se han digerido, las células permanecen unidas de forma débil, pero se pueden separar suavemente de forma mecánica. Después del aislamiento, se pueden realizar experimentos en estas células aisladas individuales, incluida la electrofisiología de fijación de parche , la obtención de imágenes por fluorescencia de calcio y la inmunocitoquímica .
Las técnicas necesarias para obtener células aisladas varían según el tipo de célula requerido. Las células circulantes, como las células sanguíneas o algunas células tumorales, se pueden aislar tomando una muestra de sangre. [1] Como las muestras de sangre contienen una mezcla de muchos tipos de células diferentes, se debe utilizar un método para separar las células en diferentes tipos. El método más comúnmente utilizado para esto es la citometría de flujo , durante la cual un analizador automático inspecciona una corriente estrecha de células. En una versión de esta técnica, se proyecta una luz sobre la corriente de células y el analizador detecta la luz reflejada o la fluorescencia antes de utilizar esta información para maniobrar rápidamente las células de interés hacia una cámara de recolección. [2]
Cuando se trabaja con tejidos sólidos, la obtención de tejido para el aislamiento de células puede ser más difícil. A veces, se puede obtener tejido humano sobrante en el momento de una cirugía planificada; por ejemplo, las muestras de la orejuela auricular derecha suelen extirparse y descartarse durante una cirugía a corazón abierto , como la cirugía de bypass de la arteria coronaria . [3] Otros tejidos, como muestras de páncreas o vejiga, se pueden tomar como biopsia. Alternativamente, el tejido de animales se obtiene con frecuencia sacrificándolos . [ 4]
Después de obtener una muestra de tejido, debe rodearse o perfundirse con una solución a una temperatura adecuada que contenga las sales y los nutrientes necesarios para mantener vivas las células. Esto puede realizarse simplemente sumergiendo el tejido en la solución, o puede implicar arreglos más complejos como la perfusión de Langendorff . [3] Las soluciones comúnmente utilizadas incluían modificaciones de la solución de Tyrode o la solución de Krebs y Henseleit. Estas soluciones contienen concentraciones precisas de electrolitos que incluyen sodio , potasio , calcio , magnesio , fosfato , cloruro y glucosa . Las concentraciones de estos electrolitos deben equilibrarse cuidadosamente, prestando atención a la presión osmótica. La acidez de la solución debe regularse, a menudo utilizando un tampón de pH como HEPES . El aislamiento de células de algunos tejidos puede mejorarse oxigenando la solución. [3] En las etapas iniciales, perfundir el tejido con una solución que no contenga calcio es útil particularmente cuando se aíslan miocitos cardíacos , ya que la ausencia de calcio provoca la separación de los discos intercalados . [5]
Luego se pueden agregar enzimas proteolíticas a la solución. Las enzimas que digieren el colágeno ( colagenasas ) se utilizan a menudo cuando se aíslan células del corazón o la vejiga. [3] [4] [6] También se pueden utilizar enzimas de uso general que digieren muchos tipos de proteínas ( proteasas ). [3] Cuando se aíslan células del tejido cerebral, pueden requerirse otras enzimas que descomponen el ADN (ADNasas). [7]
Estas enzimas, además de digerir la matriz extracelular, también pueden digerir otras proteínas importantes que son esenciales para el funcionamiento de las células de interés. Si las células están expuestas a estas enzimas durante demasiado tiempo, se produce la muerte celular, pero si no están expuestas a las enzimas durante el tiempo suficiente, la digestión de la matriz extracelular no será completa. Una vez que se han eliminado las enzimas del tejido perfundiéndolo con una segunda solución que no contiene enzimas, las células pueden separarse o disociarse mecánicamente. Una técnica sencilla para disociar las células consiste en cortar el tejido en trozos pequeños antes de agitar los trozos en una solución utilizando una pipeta. [3] [4]
Las células aisladas se pueden utilizar para estudiar cómo funcionan las células, cómo cambian en respuesta a una enfermedad y cómo se ven afectadas por los fármacos. Un ejemplo de una técnica experimental que utiliza células aisladas es la electrofisiología de fijación de parche , que se utiliza para estudiar cómo fluyen las partículas cargadas a través de la membrana celular . Las técnicas complementarias incluyen la obtención de imágenes por fluorescencia de calcio utilizando colorantes que emiten luz en respuesta al calcio para medir cómo se regula el calcio dentro de la célula, y la inmunocitoquímica, que utiliza anticuerpos marcados con un marcador fluorescente para identificar dónde se encuentran las proteínas dentro de una célula. [8] Las células aisladas también se pueden utilizar para el cultivo celular , en el que una sola célula se multiplica para crear una colonia de células. [4]
El aislamiento de células también puede utilizarse como parte de un tratamiento. El aislamiento de células de los islotes pancreáticos, seguido de su posterior cultivo y trasplante, se ha utilizado para tratar a pacientes con diabetes tipo 1. [9]