La cuantificación de virus consiste en contar o calcular la cantidad de partículas virales (viriones) en una muestra para determinar la concentración de virus. Se utiliza tanto en investigación y desarrollo (I+D) en laboratorios académicos y comerciales, como en situaciones de producción en las que la cantidad de virus en varios pasos es una variable importante que debe controlarse. Por ejemplo, la producción de vacunas basadas en virus , proteínas recombinantes que utilizan vectores virales y antígenos virales requieren la cuantificación de virus para monitorear y/o modificar continuamente el proceso con el fin de optimizar la calidad del producto y los rendimientos de producción y responder a demandas y aplicaciones en constante cambio. Otros ejemplos de casos específicos en los que es necesario cuantificar virus incluyen la detección de clones , la optimización de la multiplicidad de infecciones (MOI) y la adaptación de métodos al cultivo celular .
Existen muchas formas de clasificar los métodos de cuantificación de virus. Aquí, los métodos se agrupan según lo que se mide y en qué contexto biológico. Por ejemplo, los ensayos basados en células suelen medir las unidades infecciosas (virus activos). Otros métodos pueden medir la concentración de proteínas virales, ADN, ARN o partículas moleculares, pero no necesariamente miden la infectividad. Cada método tiene sus propias ventajas y desventajas, que a menudo determinan qué método se utiliza para aplicaciones específicas. [1]
Los ensayos basados en placa son un método comúnmente utilizado para determinar la concentración de virus en términos de dosis infecciosa . Los ensayos de placa determinan el número de unidades formadoras de placa (UFP) en una muestra de virus, que es una medida de la cantidad de virus. Este ensayo se basa en un método microbiológico realizado en placas de Petri o placas de cultivo celular de múltiples pocillos . Específicamente, una monocapa confluente de células huésped se infecta aplicando una muestra que contiene el virus en diluciones variables y luego se cubre con un medio semisólido , como agar o carboximetilcelulosa , para evitar que la infección del virus se propague indiscriminadamente, como ocurriría en un medio líquido. Una placa viral se forma después de que un virus infecta una célula dentro de la monocapa celular fija. [2] La célula infectada por el virus se lisará y propagará la infección a las células adyacentes, donde se repite el ciclo de infección a lisis. Esto creará un área de células infectadas y lisadas (placa viral) rodeada de células intactas no infectadas. La placa se puede ver con un microscopio óptico o visualmente utilizando técnicas de tinción celular (por ejemplo, tinción con una solución de violeta de cristal para visualizar células intactas frente a lisadas). [3] La formación de la placa puede tardar entre 3 y 14 días, según el virus que se esté analizando. Las placas se cuentan generalmente de forma manual y el recuento de placas, en combinación con el factor de dilución de la solución de infección (la muestra aplicada inicialmente a las células), se utiliza para calcular la cantidad de unidades formadoras de placa por unidad de volumen de muestra (UFP/ml). La cantidad de UFP/ml representa la concentración de partículas de virus infecciosas dentro de la muestra y se basa en el supuesto de que cada placa formada es representativa de una infección inicial por una partícula de virus infecciosa. [4] [5]
El ensayo de formación de focos (FFA) es una variación del ensayo de placa, pero en lugar de depender de la lisis celular para detectar la formación de placa, el FFA emplea técnicas de inmunotinción que utilizan anticuerpos marcados con fluorescencia específicos para un antígeno viral para detectar células huésped infectadas y partículas virales infecciosas antes de que se forme una placa real. El FFA es particularmente útil para cuantificar clases de virus que no lisan las membranas celulares, ya que estos virus no serían susceptibles al ensayo de placa. Al igual que el ensayo de placa, las monocapas de células huésped se infectan con varias diluciones de la muestra de virus y se dejan incubar durante un período de incubación relativamente breve (p. ej., 24 a 72 horas) bajo un medio de superposición semisólido que restringe la propagación del virus infeccioso, creando grupos localizados (focos) de células infectadas. Posteriormente, las placas se sondean con anticuerpos marcados con fluorescencia contra un antígeno viral y se utiliza microscopía de fluorescencia para contar y cuantificar el número de focos. El método FFA generalmente produce resultados en menos tiempo que los ensayos de placa o los ensayos de dosis infecciosa de cultivo de tejido al cincuenta por ciento (TCID50 ) (ver a continuación), pero puede ser más costoso en términos de reactivos y equipos requeridos. El tiempo de finalización del ensayo también depende del tamaño del área que el usuario esté contando. Un área más grande requerirá más tiempo pero puede proporcionar una representación más precisa de la muestra. Los resultados del FFA se expresan como unidades formadoras de focos por mililitro o FFU/mL. [6]
El ensayo TCID 50 (dosis infecciosa del 50 % en cultivo de tejidos) es la medida del título del virus infeccioso . Este ensayo de dilución de punto final cuantifica la cantidad de virus necesaria para matar al 50 % de los huéspedes infectados o para producir un efecto citopático en el 50 % de las células de cultivo de tejidos inoculadas. Este ensayo puede ser más común en aplicaciones de investigación clínica donde se debe determinar la dosis letal del virus o si el virus no forma placas. [ cita requerida ] Cuando se utiliza en el contexto del cultivo de tejidos, las células huésped se siembran y se añaden diluciones seriadas del virus. Después de la incubación, se observa y registra manualmente el porcentaje de muerte celular (es decir, células infectadas) para cada dilución del virus, y los resultados se utilizan para calcular matemáticamente un resultado de TCID 50. [6] [7] Debido a las claras diferencias en los métodos y principios de ensayo, los resultados de TCID 50 y pfu/mL u otros ensayos de infectividad no son equivalentes. Este método puede tardar hasta una semana debido al tiempo de infectividad celular. [8]
Dos métodos comúnmente utilizados para calcular TCID50 ( también se pueden utilizar para calcular otros tipos de punto final del 50 %, como EC50 , IC50 y LD50 ) son:
La relación teórica entre TCID50 y PFU es de aproximadamente 0,69 PFU = 1 TCID50 según la distribución de Poisson [10] , una distribución de probabilidad que describe cuántos eventos aleatorios (partículas de virus) que ocurren a una tasa promedio conocida (título de virus) es probable que ocurran en un espacio fijo (la cantidad de medio de virus en un pocillo). Sin embargo, debe enfatizarse que en la práctica, esta relación puede no ser válida incluso para la misma combinación de virus + célula, ya que los dos tipos de ensayo se configuran de manera diferente y la infectividad del virus es muy sensible a varios factores como la edad de la célula, el medio de superposición, etc. Pero la siguiente referencia define la relación de manera diferente:
Según ATTC : "Si se supone que se utiliza el mismo sistema celular, que el virus forma placas en esas células y que no se añaden procedimientos que inhiban la formación de placas, se esperaría que 1 ml de stock de virus tuviera aproximadamente la mitad de la cantidad de unidades formadoras de placas (UFP) que la TCID50 . Esto es solo una estimación, pero se basa en el razonamiento de que a menudo se esperaría que la dilución limitante que infectaría al 50% de las capas de células afectadas produzca inicialmente una sola placa en las capas de células que se infectan. En algunos casos, se pueden formar dos o más placas por casualidad y, por lo tanto, la cantidad real de UFP debe determinarse experimentalmente.
"Matemáticamente, las PFU esperadas serían algo mayores que la mitad de la TCID 50 , ya que los tubos negativos en la TCID 50 representan cero unidades formadoras de placa y los tubos positivos representan cada uno una o más unidades formadoras de placa. Se obtiene una estimación más precisa aplicando la distribución de Poisson. Donde es la proporción de tubos negativos y m es el número medio de unidades infecciosas por volumen (PFU/ml), . Para cualquier título expresado como TCID 50 , . Por lo tanto y que es ~ 0,7.
"Por lo tanto, se podría multiplicar el título de TCID50 (por ml) por 0,7 para predecir la media de PFU/ml. Al aplicar realmente dichos cálculos, recuerde que la media calculada solo será válida si los cambios en el protocolo necesarios para visualizar las placas no alteran la expresión del virus infeccioso en comparación con la expresión en las condiciones empleadas para TCID50 .
"Por lo tanto, como estimación de trabajo, se puede suponer que el material con un TCID 50 de 1 × 10 5 TCID 50 /mL producirá 0,7 × 10 5 PFU/mL". [11]
Existen varias variaciones de ensayos de cuantificación de virus basados en proteínas y anticuerpos. En general, estos métodos cuantifican la cantidad de todas las proteínas o la cantidad de una proteína viral específica en la muestra en lugar del número de células infectadas o partículas virales. La cuantificación se basa comúnmente en la detección colorimétrica o de fluorescencia . Algunas variaciones del ensayo cuantifican las proteínas directamente en una muestra, mientras que otras variaciones requieren la infección de la célula huésped y la incubación para permitir el crecimiento del virus antes de la cuantificación. La variación utilizada depende principalmente de la cantidad de proteína (es decir, proteína viral) en la muestra inicial y la sensibilidad del ensayo en sí. Si se requiere la incubación y el crecimiento del virus, a menudo se realiza la lisis/digestión celular y/o viral antes del análisis. La mayoría de los métodos basados en proteínas son relativamente rápidos y sensibles [ cita requerida ] pero requieren estándares de calidad para una calibración precisa y cuantifican la proteína, no las concentraciones reales de partículas virales. A continuación se presentan ejemplos específicos de ensayos basados en proteínas ampliamente utilizados.
El ensayo de hemaglutinación (HA) es un ensayo común de cuantificación de proteínas sin fluorescencia específico para la influenza . Se basa en el hecho de que la hemaglutinina , una proteína de superficie de los virus de la influenza, aglutina los glóbulos rojos (es decir, hace que los glóbulos rojos se agrupen). En este ensayo, las diluciones de una muestra de influenza se incuban con una solución de eritrocitos al 1% durante una hora y se determina visualmente la dilución del virus en la que se produce la primera aglutinación. El ensayo produce un resultado de unidades de hemaglutinación (HAU), con proporciones típicas de PFU a HAU en el rango de 10 6. [12] [13] [14] Este ensayo tarda ~1–2 horas en completarse.
El ensayo de inhibición de la hemaglutinación es una variante común del ensayo HA que se utiliza para medir los niveles de anticuerpos específicos de la gripe en el suero sanguíneo. En esta variante, los anticuerpos séricos contra el virus de la gripe interfieren en la adhesión del virus a los glóbulos rojos. Por lo tanto, la hemaglutinación se inhibe cuando los anticuerpos están presentes en una concentración suficiente. [15]
El ensayo de ácido bicinconínico (BCA, también conocido como ensayo de Smith) se basa en una medición colorimétrica simple y es un ensayo de cuantificación de proteínas de uso común. [16] El BCA es similar a los ensayos de proteínas de Lowry o Bradford . El reactivo de ensayo BCA fue desarrollado y fabricado comercialmente por primera vez por Pierce Chemical Company (ahora propiedad de Thermo Fisher Scientific ), que mantuvo la patente hasta 2006. [17] [18]
En el ensayo BCA, los enlaces peptídicos de una proteína reducen cuantitativamente Cu 2+ a Cu 1+ , lo que produce un color azul claro. BCA quela Cu 1+ en una proporción de 2:1, lo que da como resultado una especie de color más intenso que absorbe a 562 nm. La absorbancia de una muestra a 562 nm se utiliza para determinar la concentración de proteína a granel en la muestra. Los resultados del ensayo se comparan con curvas estándar conocidas después del análisis con un espectrofotómetro o lector de placas . [19] El tiempo total del ensayo es de 30 minutos a una hora. Si bien este ensayo es ubicuo y rápido, carece de especificidad para las proteínas virales, ya que cuenta todas las proteínas en la muestra. Por lo tanto, la preparación del virus que se va a cuantificar debe contener niveles muy bajos de proteínas de la célula huésped.
El ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas ( ELISA ) es un ensayo basado en anticuerpos que utiliza un anticuerpo específico de antígeno unido químicamente a una enzima (o unido a un segundo anticuerpo unido a una enzima) para detectar la presencia de una cantidad desconocida del antígeno (p. ej., proteína viral) en una muestra. El evento de unión anticuerpo-antígeno se detecta y/o cuantifica a través de la capacidad de la enzima de convertir un reactivo de sustrato para producir una señal detectable que luego se puede utilizar para calcular la concentración del antígeno objetivo en la muestra. [20] La peroxidasa de rábano picante (HRP) es una enzima común utilizada en esquemas ELISA debido a su capacidad para amplificar la señal y aumentar la sensibilidad del ensayo.
Existen muchas variaciones o tipos de ensayos ELISA, pero generalmente pueden clasificarse como indirectos , competitivos , tipo sándwich o inversos . [21]
El ensayo de inmunodifusión radial simple (SRID), también conocido como método Mancini, es un ensayo de proteínas que detecta la cantidad de antígeno viral específico por inmunodifusión en un medio semisólido (por ejemplo, agar). El medio contiene antisuero específico para el antígeno de interés y el antígeno se coloca en el centro del disco. A medida que el antígeno se difunde en el medio, crea un anillo de precipitado que crece hasta que se alcanza el equilibrio. El tiempo de ensayo puede variar de 10 horas a días dependiendo del tiempo de equilibrio del antígeno y el anticuerpo. El diámetro de la zona del anillo está relacionado linealmente con el logaritmo de la concentración de proteína y se compara con los diámetros de zona para los estándares de proteína conocidos para la cuantificación. [22]
La PCR cuantitativa utiliza la química de la reacción en cadena de la polimerasa para amplificar el ADN o ARN viral para producir concentraciones lo suficientemente altas para la detección y cuantificación por fluorescencia. En general, la cuantificación por qPCR se basa en diluciones seriadas de estándares de concentración conocida que se analizan en paralelo con las muestras desconocidas para la calibración y referencia. La detección cuantitativa se puede lograr utilizando una amplia variedad de estrategias de detección de fluorescencia, incluidas sondas específicas de secuencia o tintes fluorescentes no específicos como SYBR Green . [23] Las sondas específicas de secuencia, como TaqMan Molecular Beacons o Scorpion, se unen solo al ADN de la secuencia apropiada producida durante la reacción. El tinte SYBR Green se une a todo el ADN bicatenario [24] producido durante la reacción.
Si bien SYBR Green es fácil de usar, su falta de especificidad y menor sensibilidad llevan a la mayoría de los laboratorios a utilizar esquemas de detección de qPCR basados en sondas. [ cita requerida ] Existen muchas variaciones de qPCR, incluido el método de umbral comparativo, que permite la cuantificación relativa a través de la comparación de valores de Ct (ciclos de PCR que muestran aumentos estadísticamente significativos en el producto) de múltiples muestras que incluyen un estándar interno. [25]
La PCR amplifica todos los ácidos nucleicos diana , incluidos los que se originan a partir de partículas virales infecciosas intactas, de partículas virales defectuosas, así como el ácido nucleico libre en solución. Debido a esto, es probable que los resultados de qPCR (expresados en términos de copias de genoma/mL) sean mayores en cantidad que los resultados de TEM. Para la cuantificación viral, la relación de viriones completos a copias de ácido nucleico rara vez es de uno a uno. Esto se debe a que durante la replicación viral, el ácido nucleico y las proteínas virales no siempre se producen en una proporción de 1:1 y el proceso de ensamblaje viral da como resultado viriones completos, así como cápsides vacías y/o genomas virales libres en exceso. En el ejemplo del virus de la fiebre aftosa , la relación de viriones completos a copias de ARN dentro de una célula huésped que se replica activamente es de aproximadamente 1:1000. [26] Las ventajas de la titulación por qPCR incluyen un tiempo de respuesta rápido (1 a 4 horas) y sensibilidad (puede detectar una concentración mucho menor de virus que otros métodos).
La detección de pulsos resistivos sintonizables (TRPS) es un método que permite mediciones de alto rendimiento de partículas individuales de virus, a medida que pasan a través de un nanoporo de tamaño ajustable , una a la vez. [27] La técnica tiene la ventaja de determinar simultáneamente el tamaño y la concentración de partículas de virus en solución con alta resolución. Esto se puede utilizar para evaluar la estabilidad de la muestra y la contribución de los agregados, así como la concentración total de partículas virales (vp/mL). [28]
La medición basada en TRPS se realiza en un tampón iónico y no se requiere tinción previa de las muestras antes del análisis, por lo que la técnica es más rápida que aquellas que requieren un tratamiento previo con colorantes fluorescentes, con un tiempo total de preparación y medición de menos de 10 minutos por muestra. [ cita requerida ] El análisis de virus basado en TRPS está disponible comercialmente a través de los sistemas qViro-X , que tienen la capacidad de descontaminarse químicamente mediante autoclave después de que se haya realizado la medición.
Esta técnica es similar a la espectroscopia de masas de plasma acoplado inductivamente de partículas individuales (SP ICP-MS ) descubierta por Degueldre y Favarger (2003) [29] y adaptada posteriormente para otras nanopartículas (por ejemplo, coloides de oro, consulte Degueldre et al. (2006)). [30] La SP ICP-MS se adaptó para el análisis de la espectroscopia de masas de plasma acoplado inductivamente de virus individuales (SV ICPMS) en un estudio exhaustivo, es decir, Degueldre (2021). [31] Este estudio sugiere adaptar este método para la identificación y el recuento de virus individuales (SV). Con registros ICP-MS de campo sectorial multicanal (MC SF) de alta resolución en modo de detección de SV, el recuento de iones maestros y clave puede permitir el análisis y la identificación de virus individuales. El recuento de 2 a 500 unidades viriales se puede realizar en 20 s. Se propone realizar análisis en antorcha Ar para iones maestros : 12C+, 13C+, 14N+, 15N+ y iones clave 31P+, 32S+, 33S+ y 34S+. Se discuten todas las interferencias en detalle. Se recomienda el uso de MC ICP-MS de alta resolución mientras se exploran opciones con atmósferas anaeróbicas/aeróbicas para mejorar el análisis cuando se utiliza ICP-MS cuadrupolo. Se investiga la aplicación para dos tipos de virus (SARS-COV2 y bacteriófago T5) utilizando escaneo temporal y análisis de masa fija para los iones de virus seleccionados que permiten la caracterización de las especies utilizando las relaciones molares N/C, P/C y S/C y la cuantificación de su concentración numérica.
Aunque la mayoría de los citómetros de flujo no tienen la sensibilidad suficiente, [ cita requerida ] existen algunos citómetros de flujo disponibles comercialmente que se pueden utilizar para la cuantificación de virus. Un contador de virus cuantifica la cantidad de partículas de virus intactas en una muestra utilizando fluorescencia para detectar proteínas y ácidos nucleicos colocalizados. Las muestras se tiñen con dos colorantes, uno específico para proteínas y otro específico para ácidos nucleicos, y se analizan a medida que fluyen a través de un haz láser. La cantidad de partículas que producen eventos simultáneos en cada uno de los dos canales de fluorescencia distintos se determina, junto con la velocidad de flujo de la muestra medida, para calcular una concentración de partículas de virus (pv/mL). [32] Los resultados son generalmente similares en cantidad absoluta a un resultado de TEM. El ensayo tiene un rango de trabajo lineal de 10 5 –10 9 pv/mL y un tiempo de análisis de ~10 min con un tiempo de preparación de la muestra corto. [ cita requerida ]
La TEM es un tipo especializado de microscopía que utiliza un haz de electrones enfocado con un campo magnético para obtener imágenes de una muestra. La TEM proporciona imágenes con una resolución espacial 1000 veces mayor que un microscopio óptico (resolución de hasta 0,2 nm). [33] Se requiere una muestra ultrafina teñida negativamente . Las preparaciones de la muestra implican depositar las muestras en una rejilla TEM recubierta y teñirlas negativamente con un líquido opaco a los electrones. [34] Las muestras incrustadas en tejido también se pueden examinar si se cortan en secciones finas. Las preparaciones de la muestra varían según el protocolo y el usuario, pero generalmente requieren horas para completarse. Las imágenes TEM pueden mostrar partículas virales individuales y se puede utilizar un análisis de imágenes cuantitativo para determinar las concentraciones de virus. Estas imágenes de alta resolución también proporcionan información sobre la morfología de las partículas que la mayoría de los demás métodos no pueden. Los resultados cuantitativos de la TEM a menudo serán mayores que los resultados de otros ensayos [ cita requerida ] ya que todas las partículas, independientemente de la infectividad, se cuantifican en el resultado informado de partículas similares a virus por ml (vlp/mL). La TEM cuantitativa generalmente funciona bien para concentraciones de virus superiores a 106 partículas /ml. Debido al alto costo de los instrumentos y a la cantidad de espacio e instalaciones de apoyo necesarias, el equipo de TEM solo está disponible en unos pocos laboratorios.
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