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Replicación de círculo rodante

La replicación de círculo rodante produce múltiples copias de una única plantilla circular.

La replicación por círculo rodante ( RCR ) es un proceso de replicación unidireccional de ácidos nucleicos que puede sintetizar rápidamente múltiples copias de moléculas circulares de ADN o ARN , como plásmidos , genomas de bacteriófagos y el genoma de ARN circular de viroides . Algunos virus eucariotas también replican su ADN o ARN a través del mecanismo de círculo rodante.

Como versión simplificada de la replicación por círculo rodante natural , se desarrolló una técnica de amplificación de ADN isotérmica, la amplificación por círculo rodante. El mecanismo RCA se utiliza ampliamente en biología molecular y nanotecnología biomédica , especialmente en el campo de la biodetección (como método de amplificación de señales). [1]

Replicación circular del ADN

Ilustración de la replicación del círculo rodante.

La replicación del ADN en círculo rodante se inicia mediante una proteína iniciadora codificada por el ADN del plásmido o bacteriófago, que corta una hebra de la molécula de ADN circular de doble cadena en un sitio llamado origen de doble cadena o DSO. La proteína iniciadora permanece unida al extremo fosfato 5' de la hebra cortada, y el extremo hidroxilo 3' libre se libera para servir como cebador para la síntesis de ADN por la ADN polimerasa III . Usando la hebra sin cortar como plantilla, la replicación procede alrededor de la molécula de ADN circular, desplazando la hebra cortada como ADN monocatenario. El desplazamiento de la hebra cortada lo lleva a cabo una helicasa codificada por el huésped llamada PcrA (la abreviatura de copia de plásmido reducida) en presencia de la proteína de iniciación de replicación del plásmido.

La síntesis continua de ADN puede producir múltiples copias lineales monocatenarias del ADN original en una serie continua de extremo a extremo denominada concatémero . Estas copias lineales se pueden convertir en moléculas circulares bicatenarias mediante el siguiente proceso:

En primer lugar, la proteína iniciadora hace otra muesca en el ADN para terminar la síntesis de la primera cadena (la principal). A continuación, la ARN polimerasa y la ADN polimerasa III replican el ADN de origen monocatenario (SSO) para formar otro círculo bicatenario. La ADN polimerasa I elimina el cebador, reemplazándolo por ADN, y la ADN ligasa une los extremos para formar otra molécula de ADN circular bicatenario.

A modo de resumen, una replicación típica de círculo rodante de ADN tiene cinco pasos: [2]

  1. El dsDNA circular será "cortado".
  2. El extremo 3' se alarga utilizando ADN "sin mellas" como cadena principal (plantilla); el extremo 5' se desplaza.
  3. El ADN desplazado es una cadena rezagada y se convierte en una cadena bicatenaria mediante una serie de fragmentos de Okazaki .
  4. Replicación tanto de ssDNA "sin mella" como de desplazado.
  5. El ADN desplazado se circulariza.

Virología

Replicación del ADN viral

Algunos virus de ADN replican su información genómica en las células huésped mediante la replicación en círculo rodante. Por ejemplo, el virus del herpes humano-6 (HHV-6)(hibv) expresa un conjunto de "genes tempranos" que se cree que están involucrados en este proceso. [3] Los largos concatémeros resultantes son posteriormente escindidos entre las regiones pac-1 y pac-2 del genoma del HHV-6 por ribozimas cuando se empaqueta en viriones individuales. [4]

Un modelo para la replicación en círculo rodante del virus HPV16.

El virus del papiloma humano-16 (HPV-16) es otro virus que emplea la replicación continua para producir progenie a un ritmo elevado. El HPV-16 infecta las células epiteliales humanas y tiene un genoma circular de doble cadena. Durante la replicación, en el origen, el hexámero E1 se enrolla alrededor de la cadena simple de ADN y se mueve en la dirección 3' a 5'. En la replicación bidireccional normal, las dos proteínas de replicación se disocian en el momento de la colisión, pero en el HPV-16 se cree que el hexámero E1 no se disocia, lo que conduce a una replicación continua. Se cree que este mecanismo de replicación del HPV puede tener implicaciones fisiológicas en la integración del virus en el cromosoma del huésped y la eventual progresión al cáncer de cuello uterino. [5]

Además, el geminivirus también utiliza la replicación en círculo rodante como mecanismo de replicación. Es un virus responsable de la destrucción de muchos cultivos importantes, como la mandioca, el algodón, las legumbres, el maíz, el tomate y el quimbombó. El virus tiene un ADN circular, monocatenario, que se replica en las células de la planta huésped. Todo el proceso es iniciado por la proteína iniciadora de la replicación del geminivirus, Rep, que también es responsable de alterar el entorno del huésped para actuar como parte de la maquinaria de replicación. Rep también es sorprendentemente similar a la mayoría de las demás proteínas iniciadoras de la replicación rodante de las eubacterias, con la presencia de los motivos I, II y III en su extremo N. Durante la replicación en círculo rodante, el ssADN del geminivirus se convierte en dsADN y Rep se une al dsADN en la secuencia de origen TAATATTAC. Después de que Rep, junto con otras proteínas de replicación, se une al dsADN, forma un bucle de tallo donde el ADN se escinde en la secuencia del nanómero, lo que provoca un desplazamiento de la hebra. Este desplazamiento permite que la horquilla de replicación progrese en la dirección 3' a 5', lo que finalmente produce una nueva cadena de ADNss y una cadena de ADN concatemérica. [6]

Los intermediarios de replicación del ADN del bacteriófago T4 incluyen estructuras concateméricas circulares y ramificadas . [7] Estas estructuras probablemente reflejan un mecanismo de replicación de círculo rodante.

Replicación del ARN viral

Algunos virus ARN y viroides también replican su genoma mediante la replicación del ARN en círculo rodante. En el caso de los viroides, existen dos vías alternativas de replicación del ARN que siguen respectivamente los miembros de la familia Pospiviroidae (replicación asimétrica) y Avsunviroidae (replicación simétrica).

Replicación en círculo rodante del ARN viral

En la familia Pospiviroidae (similar a PSTVd), la ARN polimerasa del huésped transcribe la cadena positiva circular del ARN en cadenas negativas oligoméricas y luego en cadenas positivas oligoméricas. [8] Estas cadenas positivas oligoméricas son escindidas por una ARNasa del huésped y ligadas por una ARN ligasa del huésped para reformar el ARN circular de cadena positiva monomérica. Esto se denomina vía asimétrica de replicación en círculo rodante. Los viroides de la familia Avsunviroidae (similar a ASBVd) replican su genoma a través de la vía simétrica de replicación en círculo rodante. [9] En esta vía simétrica, las cadenas negativas oligoméricas primero se escinden y ligan para formar cadenas negativas monoméricas, y luego se transcriben en cadenas positivas oligoméricas. Estas cadenas positivas oligoméricas luego se escinden y ligan para reformar la cadena positiva monomérica. La vía de replicación simétrica recibió ese nombre porque tanto las cadenas positivas como las negativas se producen de la misma manera.

La escisión de las cadenas oligoméricas más y menos está mediada por la estructura de ribozima de cabeza de martillo autoescindible presente en Avsunviroidae, pero dicha estructura está ausente en Pospiviroidae. [10]

Amplificación por círculo rodante (RCA)

El mecanismo molecular de la amplificación por círculo rodante (RCA)

La forma derivada de la replicación por círculo rodante se ha utilizado con éxito para la amplificación de ADN a partir de cantidades muy pequeñas de material de partida. [1] Esta técnica de amplificación se denomina amplificación por círculo rodante (RCA). A diferencia de las técnicas de amplificación de ADN convencionales, como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) , la RCA es una técnica de amplificación de ácidos nucleicos isotérmica en la que la polimerasa añade continuamente nucleótidos individuales a un cebador hibridado con una plantilla circular, lo que da como resultado un ADN monocatemérico largo que contiene decenas a cientos de repeticiones en tándem (complementarias a la plantilla circular). [11]

Hay cinco componentes importantes necesarios para realizar una reacción RCA:

  1. Una ADN polimerasa
  2. Un tampón adecuado que sea compatible con la polimerasa.
  3. Un cebador corto de ADN o ARN
  4. Una plantilla de ADN circular
  5. Desoxinucleótidos trifosfato (dNTP)
Los métodos de detección del producto RCA

Las polimerasas utilizadas en la RCA son la ADN polimerasa Phi29 , Bst y Vent exo para la amplificación del ADN, y la ARN polimerasa T7 para la amplificación del ARN. Dado que la ADN polimerasa Phi29 tiene la mejor procesividad y capacidad de desplazamiento de cadena entre todas las polimerasas mencionadas anteriormente, se ha utilizado con mayor frecuencia en las reacciones de RCA. A diferencia de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), la RCA se puede realizar a una temperatura constante (temperatura ambiente a 65 °C) tanto en solución libre como sobre objetivos inmovilizados (amplificación en fase sólida).

Normalmente hay tres pasos involucrados en una reacción RCA de ADN:

  1. Ligadura de plantilla circular, que puede realizarse mediante ligadura enzimática mediada por plantilla (por ejemplo, ADN ligasa T4) o ligadura sin plantilla utilizando ligasas de ADN especiales (es decir, CircLigase).
  2. Elongación de ADN monocatenario inducida por cebadores . Se pueden emplear múltiples cebadores para hibridar con el mismo círculo. Como resultado, se pueden iniciar múltiples eventos de amplificación, lo que produce múltiples productos RCA ("RCA multicebada").
  3. Detección y visualización de productos de amplificación, que se lleva a cabo más comúnmente mediante detección fluorescente, con dNTP conjugado con fluoróforo, marcadores moleculares complementarios unidos a fluoróforo o marcados con fluoróforo . Además de los métodos fluorescentes, la electroforesis en gel también se utiliza ampliamente para la detección de productos RCA.

La RCA produce una amplificación lineal del ADN, ya que cada plantilla circular crece a una velocidad determinada durante un tiempo determinado. Para aumentar el rendimiento y lograr una amplificación exponencial como la PCR, se han investigado varios enfoques. Uno de ellos es la amplificación por círculo rodante hiperramificado o HRCA, en la que se añaden cebadores que se unen a los productos RCA originales y también se extienden. [12] De esta manera, el RCA original crea más plantillas que se pueden amplificar. Otra es la amplificación de círculo a círculo o C2CA, en la que los productos RCA se digieren con una enzima de restricción y se ligan a nuevas plantillas circulares utilizando un oligonucleótido de restricción, seguido de una nueva ronda de RCA con una mayor cantidad de plantillas circulares para la amplificación. [13]

Aplicaciones de RCA

Ilustración de inmuno-RCA

La RCA puede amplificar un único evento de unión molecular más de mil veces, lo que la hace particularmente útil para detectar objetivos con una abundancia ultrabaja. Las reacciones de RCA se pueden realizar no solo en entornos de solución libre, sino también en una superficie sólida como vidrio, microesferas o nanoesferas, placas de micropocillos, dispositivos microfluídicos o incluso tiras de papel. Esta característica la convierte en una herramienta muy poderosa para amplificar señales en inmunoensayos en fase sólida (por ejemplo, ELISA ). De esta manera, la RCA se está convirtiendo en una herramienta de amplificación de señales muy versátil con amplias aplicaciones en genómica, proteómica, diagnóstico y biodetección.

Inmuno-RCA

La inmuno-RCA es un método de amplificación de señales isotérmicas para la detección y cuantificación de proteínas con alta especificidad y alta sensibilidad. Esta técnica combina dos campos: la RCA, que permite la amplificación de nucleótidos, y el inmunoensayo, que utiliza anticuerpos específicos para biomarcadores intracelulares o libres. Como resultado, la inmuno-RCA proporciona una señal amplificada específica (alta relación señal-ruido), lo que la hace adecuada para detectar, cuantificar y visualizar marcadores proteicos de baja abundancia en inmunoensayos en fase líquida [14] [15] [16] e inmunohistoquímica .

La inmunorreacción RCA sigue una reacción inmunoadsorbente típica en tinción de tejido por ELISA o inmunohistoquímica. [17] Los anticuerpos de detección utilizados en la reacción inmunorreacción RCA se modifican uniendo un oligonucleótido de ssADN en el extremo de las cadenas pesadas. De esta forma, la sección Fab (fragmento de unión al antígeno) del anticuerpo de detección puede seguir uniéndose a antígenos específicos y el oligonucleótido puede servir como cebador de la reacción RCA.

El procedimiento típico de inmuno-RCA mediado por anticuerpos es el siguiente:

Ilustración de inmuno-RCA basada en aptámeros

1. Un anticuerpo de detección reconoce un objetivo proteico específico. Este anticuerpo también está unido a un cebador de oligonucleótidos.

2. Cuando hay ADN circular, se une y el cebador coincide con la secuencia complementaria del ADN circular.

3. La secuencia complementaria de la plantilla de ADN circular se copia cientos de veces y permanece unida al anticuerpo.

4. La salida RCA (ssDNA alargado) se detecta con sondas fluorescentes utilizando un microscopio fluorescente o un lector de microplacas.

Aptámerobasado en inmuno-RCA[18]

Además de la inmuno-RCA mediada por anticuerpos, el cebador RCA de ssDNA también se puede conjugar con el extremo 3' de un aptámero de ADN. La cola del cebador se puede amplificar mediante amplificación por círculo rodante. El producto se puede visualizar mediante el etiquetado de un marcador fluorescente. [19] El proceso se ilustra en la figura de la derecha.

Otras aplicaciones de RCA

Varios derivados de RCA se han utilizado ampliamente en el campo de la biodetección. Por ejemplo, RCA se ha utilizado con éxito para detectar la existencia de ADN viral y bacteriano en muestras clínicas, [20] [21] lo que resulta muy beneficioso para el diagnóstico rápido de enfermedades infecciosas . También se ha utilizado como método de amplificación de señales en chip para ensayos de microarrays de ácidos nucleicos (tanto de ADN como de ARN) . [1]

Además de la función de amplificación en aplicaciones de biodetección, la técnica RCA se puede aplicar también a la construcción de nanoestructuras de ADN e hidrogeles de ADN. Los productos de RCA también se pueden utilizar como plantillas para el ensamblaje periódico de nanoespecies o proteínas, la síntesis de nanocables metálicos [22] y la formación de nanoislas [1] .

Véase también

Referencias

  1. ^ abcd Ali, M. Monsur; Li, Feng; Zhang, Zhiqing; Zhang, Kaixiang; Kang, Dong-Ku; Ankrum, James A.; Le, X. Chris; Zhao, Weian (2014). "Amplificación por círculo rodante: una herramienta versátil para la biología química, la ciencia de los materiales y la medicina". Chemical Society Reviews . 43 (10): 3324–41. doi :10.1039/C3CS60439J. PMID  24643375.
  2. ^ Demidov, Vadim V, ed. (2016). Amplificación de círculo rodante (RCA): hacia una nueva perspectiva clínica | Vadim V. Demidov | Springer. doi :10.1007/978-3-319-42226-8. ISBN 9783319422244. Número de identificación del sujeto  30024718.
  3. ^ Arbuckle, Jesse (2011). "La biología molecular de la latencia del herpesvirus humano-6 y la integración de los telómeros". Microbes and Infection . 13 (8–9): 731–741. doi :10.1016/j.micinf.2011.03.006. PMC 3130849 . PMID  21458587. 
  4. ^ Borenstein, Ronen; Frenkel, Niza (2009). "Clonación del genoma del virus del herpes humano 6A en cromosomas artificiales bacterianos y estudio de intermediarios de replicación del ADN". Actas de la Academia Nacional de Ciencias . 106 (45): 19138–19143. Bibcode :2009PNAS..10619138B. doi : 10.1073/pnas.0908504106 . PMC 2767366 . PMID  19858479. 
  5. ^ Kusumoto-Matsuo, Rika; Kanda, Tadahito; Kukimoto, Iwao (1 de enero de 2011). "Replicación en círculo rodante del ADN del virus del papiloma humano tipo 16 en extractos de células epiteliales". De genes a células . 16 (1): 23–33. doi : 10.1111/j.1365-2443.2010.01458.x . ISSN  1365-2443. PMID  21059156. S2CID  30493728.
  6. ^ Rizvi, Irum; Choudhury, Nirupam Roy; Tuteja, Narendra (1 de febrero de 2015). "Información sobre las características funcionales de la proteína iniciadora de replicación de círculo rodante del geminivirus y su interacción con factores del huésped que afectan la replicación del ADN viral". Archivos de Virología . 160 (2): 375–387. doi :10.1007/s00705-014-2297-7. ISSN  0304-8608. PMID  25449306. S2CID  16502010.
  7. ^ Bernstein H, Bernstein C (julio de 1973). "Concatenaciones circulares y ramificadas como posibles intermediarios en la replicación del ADN del bacteriófago T4". J. Mol. Biol . 77 (3): 355–61. doi :10.1016/0022-2836(73)90443-9. PMID  4580243.
  8. ^ Daròs, José-Antonio; Elena, Santiago F.; Flores, Ricardo (junio de 2006). "Viroides: un hilo de Ariadna en el laberinto del ARN". EMBO Reports . 7 (6): 593–598. doi :10.1038/sj.embor.7400706. ISSN  1469-221X. PMC 1479586 . PMID  16741503. 
  9. ^ Tsagris, Efthimia Mina; Martínez de Alba, Ángel Emilio; Gozmanova, Mariyana; Kalantidis, Kriton (1 de noviembre de 2008). "Viroides". Microbiología Celular . 10 (11): 2168–2179. doi : 10.1111/j.1462-5822.2008.01231.x . ISSN  1462-5822. PMID  18764915.
  10. ^ Flores, Ricardo; Gas, María-Eugenia; Molina-Serrano, Diego; Nohales, María-Ángeles; Carbonell, Alberto; Gago, Selma; De la Peña, Marcos; Daròs, José-Antonio (14 de septiembre de 2009). "Replicación de viroides: círculos rodantes, enzimas y ribozimas". Virus . 1 (2): 317–334. doi : 10.3390/v1020317 . PMC 3185496 . PMID  21994552. 
  11. ^ Ali, M. Monsur; Li, Feng; Zhang, Zhiqing; Zhang, Kaixiang; Kang, Dong-Ku; Ankrum, James A.; Le, X. Chris; Zhao, Weian (21 de mayo de 2014). "Amplificación por círculo rodante: una herramienta versátil para la biología química, la ciencia de los materiales y la medicina". Chemical Society Reviews . 43 (10): 3324–3341. doi :10.1039/c3cs60439j. ISSN  1460-4744. PMID  24643375.
  12. ^ Lizardi, Paul M.; Huang, Xiaohua; Zhu, Zhengrong; Bray-Ward, Patricia; Thomas, David C.; Ward, David C. (julio de 1998). "Detección de mutaciones y recuento de moléculas individuales mediante amplificación isotérmica por círculo rodante". Nature Genetics . 19 (3): 225–232. doi :10.1038/898. ISSN  1546-1718. PMID  9662393. S2CID  21007563.
  13. ^ Dahl, Fredrik; Banér, Johan; Gullberg, Mats; Mendel-Hartvig, Maritha; Landegren, Ulf; Nilsson, Mats (30 de marzo de 2004). "Amplificación de círculo a círculo para un análisis de ADN preciso y sensible". Actas de la Academia Nacional de Ciencias . 101 (13): 4548–4553. Bibcode :2004PNAS..101.4548D. doi : 10.1073/pnas.0400834101 . ISSN  0027-8424. PMC 384784 . PMID  15070755. 
  14. ^ Schweitzer, Barry; Roberts, Scott; Grimwade, Brian; Shao, Weiping; Wang, Minjuan; Fu, Qin; Shu, Quiping; Laroche, Isabelle; Zhou, Zhimin (abril de 2002). "Perfiles de proteínas multiplexados en microarreglos mediante amplificación por círculo rodante". Nature Biotechnology . 20 (4): 359–365. doi :10.1038/nbt0402-359. ISSN  1087-0156. PMC 2858761 . PMID  11923841. 
  15. ^ Zhou, Long; Ou, Li-Juan; Chu, Xia; Shen, Guo-Li; Yu, Ru-Qin (2007). "Amplificación por círculo rodante basada en aptámeros: una plataforma para la detección electroquímica de proteínas". Química analítica . 79 (19): 7492–7500. doi :10.1021/ac071059s. PMID  17722881.
  16. ^ Björkesten, Johan; Patil, Surabh; Fredolini, Claudia; Lönn, Peter; Landegren, Ulf (29 de mayo de 2020). "Una plataforma multiplex para la medición digital de productos de reacción de ADN circular". Investigación de ácidos nucleicos . 48 (13): gkaa419. doi : 10.1093/nar/gkaa419. ISSN  0305-1048. PMC 7367203 . PMID  32469060. 
  17. ^ Gusev, Y.; Sparkowski, J.; Raghunathan, A.; Ferguson, H.; Montano, J.; Bogdan, N.; Schweitzer, B.; Wiltshire, S.; Kingsmore, SF (julio de 2001). "Amplificación por círculo rodante: un nuevo enfoque para aumentar la sensibilidad de la inmunohistoquímica y la citometría de flujo". The American Journal of Pathology . 159 (1): 63–69. doi :10.1016/S0002-9440(10)61674-4. ISSN  0002-9440. PMC 1850404 . PMID  11438455. 
  18. ^ Zhao, Weian; Ali, M. Monsur; Brook, Michael A.; Li, Yingfu (11 de agosto de 2008). "Amplificación por círculo rodante: aplicaciones en nanotecnología y biodetección con ácidos nucleicos funcionales". Angewandte Chemie International Edition . 47 (34): 6330–6337. doi :10.1002/anie.200705982. ISSN  1521-3773. PMID  18680110.
  19. ^ Zhou, Long; Ou, Li-Juan; Chu, Xia; Shen, Guo-Li; Yu, Ru-Qin (1 de octubre de 2007). "Amplificación por círculo rodante basada en aptámeros: una plataforma para la detección electroquímica de proteínas". Química analítica . 79 (19): 7492–7500. doi :10.1021/ac071059s. ISSN  0003-2700. PMID  17722881.
  20. ^ Chen, Xiaoyou; Wang, Bin; Yang, Wen; Kong, Fanrong; Li, Chuanyou; Sun, Zhaogang; Jelfs, Peter; Gilbert, Gwendolyn L. (1 de mayo de 2014). "Amplificación por círculo rodante para la detección directa de mutaciones del gen rpoB en aislamientos de Mycobacterium tuberculosis de muestras clínicas". Revista de microbiología clínica . 52 (5): 1540–1548. doi :10.1128/JCM.00065-14. ISSN  0095-1137. PMC 3993705 . PMID  24574296. 
  21. ^ Liu, Yang; Guo, Yan-Ling; Jiang, Guang-Lu; Zhou, Shi-Jie; Sol, Qi; Chen, Xi; Chang, Xiu-Jun; Xing, Ai-Ying; Du, Feng-Jiao (4 de junio de 2013). "Aplicación de la amplificación del círculo rodante hiperramificado para la detección directa de Mycobacterium tuberculosis en muestras clínicas de esputo". MÁS UNO . 8 (6): e64583. Código Bib : 2013PLoSO...864583L. doi : 10.1371/journal.pone.0064583 . ISSN  1932-6203. PMC 3672175 . PMID  23750210. 
  22. ^ Guo, Maoxiang; Hernández-Neuta, Iván; Madaboosi, Narayanan; Nilsson, Mats; Wijngaart, Wouter van der (12 de febrero de 2018). "Síntesis eficiente de nanocables de oro transmembrana asistida por ADN". Microsistemas y nanoingeniería . 4 : 17084. doi : 10.1038/micronano.2017.84 . ISSN  2055-7434.

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