La pantalla azul-blanca es una técnica de detección que permite la detección rápida y conveniente de bacterias recombinantes en experimentos de clonación molecular basados en vectores . Este método de detección se realiza generalmente utilizando una cepa bacteriana adecuada , pero también se pueden utilizar otros organismos como la levadura. El ADN de transformación se liga a un vector . Luego, el vector se inserta en una célula huésped competente viable para la transformación, que luego se cultiva en presencia de X-gal . Las células transformadas con vectores que contienen ADN recombinante producirán colonias blancas; las células transformadas con plásmidos no recombinantes (es decir, solo el vector) crecen en colonias azules.
La clonación molecular es uno de los procedimientos más utilizados en biología molecular . Un gen de interés puede insertarse en un vector plasmídico mediante ligación y, a continuación, el plásmido se transforma en células de Escherichia coli . Sin embargo, no todos los plásmidos transformados en células pueden contener el inserto génico deseado, y comprobar la presencia del inserto en cada colonia individual requiere mucho tiempo. Por lo tanto, sería útil contar con un método para la detección del inserto que hiciera que este procedimiento fuera menos laborioso y llevara menos tiempo. Uno de los primeros métodos desarrollados para la detección del inserto es el cribado azul-blanco, que permite identificar los productos exitosos de las reacciones de clonación a través del color de la colonia bacteriana .
El método se basa en el principio de la α-complementación del gen de la β-galactosidasa . Este fenómeno de α-complementación se demostró por primera vez en el trabajo realizado por Agnes Ullmann en el laboratorio de François Jacob y Jacques Monod , donde se demostró que la función de una β-galactosidasa mutante inactiva con secuencia eliminada se rescataba mediante un fragmento de β-galactosidasa en el que esa misma secuencia, el péptido donador α, todavía estaba intacta. [1] Langley et al. demostraron que la β-galactosidasa mutante no funcional carecía de parte de su extremo N con sus residuos 11-41 eliminados, pero puede complementarse con un péptido formado por los residuos 3-90 de la β-galactosidasa. [2] El fago filamentoso M13 que contiene la secuencia que codifica los primeros 145 aminoácidos fue construido posteriormente por Messing et al. , y la α-complementación mediante el uso de un vector se demostró mediante la formación de placas azules cuando las células que contenían la proteína inactiva fueron infectadas por el fago y luego cultivadas en placas que contenían X-gal. [3]
La serie pUC de vectores de clonación de plásmidos de Vieira y Messing se desarrolló a partir del sistema M13 y fueron los primeros plásmidos construidos para aprovechar este método de detección. [4] En este método, el ADN ligado al plásmido interrumpe el péptido α y, por lo tanto, el proceso de complementación, y no se puede formar una β-galactosidasa funcional. Por lo tanto, las células transformadas con plásmido que contiene un inserto forman colonias blancas, mientras que las células transformadas con plásmido sin inserto forman colonias azules; el resultado de una ligadura exitosa se puede identificar fácilmente por la coloración blanca de las células formadas a partir de las azules fallidas. [5]
La β-galactosidasa es una proteína codificada por el gen lacZ del operón lac y existe como homotetrámero en su estado activo. Sin embargo, una β-galactosidasa mutante derivada de la cepa M15 de E. coli tiene sus residuos N-terminales 11-41 eliminados y este mutante, el péptido ω, es incapaz de formar un tetrámero y está inactivo. Sin embargo, esta forma mutante de proteína puede regresar completamente a su estado tetramérico activo en presencia de un fragmento N-terminal de la proteína, el péptido α. El rescate de la función de la β-galactosidasa mutante por el péptido α se llama α-complementación.
En este método de detección, la cepa huésped de E. coli lleva el mutante de deleción lacZ ( lacZΔM15 ) que contiene el péptido ω, mientras que los plásmidos utilizados llevan la secuencia lacZα que codifica los primeros 59 residuos de la β-galactosidasa, el péptido α. Ninguno es funcional por sí mismo. Sin embargo, cuando los dos péptidos se expresan juntos, como cuando un plásmido que contiene la secuencia lacZα se transforma en células lacZΔM15 , forman una enzima β-galactosidasa funcional .
El método de cribado azul-blanco funciona interrumpiendo este proceso de complementación α. El plásmido lleva dentro de la secuencia lacZα un sitio de clonación múltiple (MCS) interno. Este MCS dentro de la secuencia lacZα puede cortarse mediante enzimas de restricción para que el ADN extraño pueda insertarse dentro del gen lacZ α, interrumpiendo así el gen que produce el péptido α. En consecuencia, en las células que contienen el plásmido con un inserto, no puede formarse β-galactosidasa funcional.
La presencia de una β-galactosidasa activa puede detectarse mediante X-gal , un análogo incoloro de la lactosa que puede ser escindido por la β-galactosidasa para formar 5-bromo-4-cloro-indoxilo, que luego se dimeriza y oxida espontáneamente para formar un pigmento insoluble azul brillante 5,5'-dibromo-4,4'-dicloro-índigo. Esto da como resultado un color azul característico en las células que contienen una β-galactosidasa funcional. Por lo tanto, las colonias azules muestran que pueden contener un vector con un lacZα ininterrumpido (por lo tanto, sin inserto), mientras que las colonias blancas, donde X-gal no está hidrolizado, indican la presencia de un inserto en lacZα que interrumpe la formación de una β-galactosidasa activa.
Los clones recombinantes se pueden analizar más a fondo aislando y purificando pequeñas cantidades de ADN plasmídico de las colonias transformadas y se pueden utilizar enzimas de restricción para cortar el clon y determinar si tiene el fragmento de interés. [6] Si es necesario secuenciar el ADN, será necesario aislar los plásmidos de las colonias en un punto, ya sea para cortarlos utilizando enzimas de restricción o realizando otros ensayos.
El tipo correcto de vector y las células competentes son consideraciones importantes al planificar una prueba de detección de glucosa azul-blanca. El plásmido debe contener el gen lacZ α, y ejemplos de tales plásmidos son pUC19 y pBluescript. La célula de E. coli debe contener el gen lacZ mutante con secuencia eliminada (es decir, lacZΔM15 ), y algunas de las células comúnmente utilizadas con dicho genotipo son JM109, DH5α y XL1-Blue. También debe entenderse que el operón lac se ve afectado por la presencia de glucosa. La proteína EIIA Glc , que está involucrada en la importación de glucosa, desactiva la permeasa de lactosa cuando la glucosa se transporta a la célula. Por lo tanto, el medio utilizado en la placa de agar no debe incluir glucosa.
X-gal es sensible a la luz y, por lo tanto, su solución y las placas que contienen X-gal deben almacenarse en la oscuridad. El isopropil β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG), que funciona como inductor del operón lac , puede utilizarse en el medio para mejorar la expresión de LacZ.
El X-gal es un material caro, por lo que se han desarrollado otros métodos para detectar bacterias. El GFP se ha desarrollado como una alternativa para ayudar a detectar bacterias. El concepto es similar a la α-complementación en la que un inserto de ADN puede alterar la secuencia codificante dentro de un vector y, por lo tanto, interrumpir la producción de GFP, lo que da como resultado bacterias no fluorescentes. [7] Las bacterias que tienen vectores recombinantes (vector + inserto) serán blancas y no expresarán la proteína GFP, mientras que las no recombinantes (vector) sí lo harán y emitirán fluorescencia bajo la luz ultravioleta. El GFP en general se ha utilizado como un gen reportero donde las personas pueden determinar definitivamente si un clon porta un gen que los investigadores están analizando. En ocasiones, el medio en el que crecen las colonias puede influir en la detección e introducir resultados falsos positivos. [8 ] El X-gal en el medio puede degradarse ocasionalmente para producir un color azul o el GFP puede perder su fluorescencia debido al medio y puede afectar las capacidades de los investigadores para determinar las colonias con el recombinante deseado y las que no lo poseen. [9]
Algunas colonias blancas pueden no contener el plásmido recombinante deseado por diversas razones. El ADN ligado puede no ser el correcto o no estar ligado adecuadamente, y es posible que algún vector linealizado se transforme, sus extremos se "reparen" y se ligen entre sí de modo que no se produzca LacZα y no se formen colonias azules. La mutación también puede provocar que no se exprese el fragmento α. Una colonia sin vector en absoluto también aparecerá blanca y, a veces, puede aparecer como colonias satélite después de que se haya agotado el antibiótico utilizado. También es posible que las colonias azules puedan contener el inserto. Esto ocurre cuando el inserto está "en marco" con el gen LacZα y falta un codón de parada en el inserto. Esto puede provocar la expresión de una proteína de fusión que tiene un LacZα funcional si su estructura no se altera. El constructo recombinante correcto a veces puede dar colonias de un azul más claro que pueden complicar su identificación.
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