Los biorreportadores son células microbianas vivas e intactas que han sido modificadas genéticamente para producir una señal medible en respuesta a un agente químico o físico específico en su entorno . Los biorreportadores contienen dos elementos genéticos esenciales, un gen promotor y un gen reportero . El gen promotor se activa ( se transcribe ) cuando el agente objetivo está presente en el entorno de la célula. El gen promotor en una célula bacteriana normal está vinculado a otros genes que luego también se transcriben y luego se traducen en proteínas que ayudan a la célula a combatir o adaptarse al agente al que ha estado expuesta. En el caso de un biorreportador, estos genes, o partes de ellos, se han eliminado y reemplazado por un gen reportero. Como resultado, la activación del gen promotor también activa el gen reportero, lo que lleva a la producción de proteínas reporteras que emiten una señal detectable. La presencia de una señal indica que el biorreportador ha detectado un agente particular en su entorno.
Originalmente desarrollados para el análisis fundamental de los factores que afectan la expresión genética , los bioreporteros se aplicaron tempranamente para la detección de contaminantes ambientales [1] y desde entonces han evolucionado hacia campos tan diversos como el diagnóstico médico , la agricultura de precisión , el aseguramiento de la seguridad alimentaria , el control y monitoreo de procesos y la computación biomicroelectrónica . Su versatilidad se debe al hecho de que existe una gran cantidad de sistemas de genes reporteros que son capaces de generar una variedad de señales. Además, los genes reporteros se pueden insertar genéticamente en células bacterianas , de levadura , de plantas y de mamíferos , lo que proporciona una funcionalidad considerable en una amplia gama de vectores hospedadores.
Existen varios tipos de genes reporteros disponibles para su uso en la construcción de organismos bioreporteros, y las señales que generan generalmente se pueden clasificar como colorimétricas , fluorescentes , luminiscentes , quimioluminiscentes o electroquímicas . Aunque cada uno funciona de manera diferente, su producto final siempre es el mismo: una señal medible que es proporcional a la concentración del agente químico o físico único al que han sido expuestos. En algunos casos, la señal solo se produce cuando se agrega un sustrato secundario al bioensayo ( luxAB , Luc y aequorina). Para otros bioreporteros, la señal debe activarse mediante una fuente de luz externa (GFP y UMT), y para unos pocos bioreporteros seleccionados, la señal es completamente autoinducida, sin que se requiera un sustrato exógeno o activación externa ( luxCDABE ). Las siguientes secciones describen brevemente algunos de los sistemas de genes reporteros disponibles y sus aplicaciones existentes.
Luciferasa es un nombre genérico para una enzima que cataliza una reacción de emisión de luz. Las luciferasas se pueden encontrar en bacterias, algas, hongos, medusas, insectos, camarones y calamares, y la luz resultante que estos organismos producen se denomina bioluminiscencia. En las bacterias, los genes responsables de la reacción de emisión de luz (los genes lux ) se han aislado y utilizado ampliamente en la construcción de biorreporteros que emiten una luz azul-verde con una intensidad máxima a 490 nm. [2] Hay tres variantes de lux disponibles, una que funciona a < 30 °C, otra a < 37 °C y una tercera a < 45 °C. El sistema genético lux consta de cinco genes, luxA , luxB , luxC , luxD y luxE . Dependiendo de la combinación de estos genes utilizados, se pueden construir varios tipos diferentes de biorreporteros bioluminiscentes .
Los bioreporteros luxAB contienen únicamente los genes luxA y luxB , que juntos son responsables de generar la señal luminosa. Sin embargo, para completar por completo la reacción de emisión de luz, se debe suministrar un sustrato a la célula. Por lo general, esto ocurre mediante la adición del decanal químico en algún momento durante el procedimiento de bioensayo. Se han construido numerosos bioreporteros luxAB dentro de sistemas celulares de bacterias, levaduras, insectos, nematodos, plantas y mamíferos.
En lugar de contener únicamente los genes luxA y luxB , los bioreporteros pueden contener los cinco genes del casete lux , lo que permite un sistema de generación de luz completamente independiente que no requiere adiciones extrañas de sustrato ni excitación por una fuente de luz externa. Por lo tanto, en este bioensayo, el bioreportero simplemente se expone a un analito objetivo y se obtiene un aumento cuantitativo en los resultados de bioluminiscencia, a menudo en menos de una hora. Debido a su rapidez y facilidad de uso, junto con la capacidad de realizar el bioensayo de manera repetitiva en tiempo real y en línea, los bioreporteros luxCDABE son extremadamente atractivos. En consecuencia, se han incorporado a una amplia gama de metodologías de detección que van desde la detección de contaminantes ambientales hasta el monitoreo en tiempo real de infecciones por patógenos en ratones vivos.
Los biorreportadores de lux no específicos se utilizan normalmente para la detección de toxinas químicas. Suelen estar diseñados para emitir bioluminiscencia de forma continua. Tras la exposición a una toxina química, la célula muere o su actividad metabólica se retrasa, lo que provoca una disminución de los niveles de luz bioluminiscente . Su aplicación más conocida es en el ensayo Microtox, donde, tras una breve exposición a varias concentraciones de la muestra, la disminución de la bioluminiscencia se puede correlacionar con niveles relativos de toxicidad . [3] [4]
La luciferasa de luciérnaga cataliza una reacción que produce luz visible en el rango de 550 a 575 nm. También existe una luciferasa de luciérnaga que produce luz en un pico más cercano a 595 nm. Ambas luciferasas requieren la adición de un sustrato exógeno (luciferina) para que se produzca la reacción luminosa. Se han construido numerosos biorreportadores basados en luc para la detección de una amplia gama de compuestos inorgánicos y orgánicos de interés ambiental. Sin embargo, las aplicaciones más prometedoras probablemente dependan de la introducción del código genético de la luciferasa de luciérnaga en otras células y tejidos eucariotas. [5]
La inserción de los genes luc en una línea celular de carcinoma cervical humano ( HeLa ) ilustró que la eliminación de células tumorales se podía visualizar dentro de un ratón vivo simplemente escaneando con una cámara de dispositivo acoplado a carga , lo que permitió que el tratamiento de quimioterapia se monitoreara rápidamente en línea y en tiempo real. [6] En otro ejemplo, los genes luc se insertaron en líneas celulares de cáncer de mama humano para desarrollar un bioensayo para la detección y medición de sustancias con potencial actividad estrogénica y antiestrogénica. [7]
Se pueden colocar promotores particulares aguas arriba del gen luc , es decir, la secuencia luc se puede fusionar a la secuencia promotora a nivel de ADN. Si dicho constructo no es demasiado grande, se puede introducir simplemente en células eucariotas utilizando plásmidos . Este enfoque se utiliza ampliamente para estudiar la actividad de un promotor dado en un tipo de célula/tejido dado, ya que la cantidad de luz producida por la luciferasa es directamente proporcional a la actividad del promotor. [8] Además de estudiar los promotores, los ensayos de luciferasa de luciérnaga ofrecen la opción de estudiar activadores transcripcionales : en estos experimentos, normalmente se utiliza el sistema GAL4/UAS_system y su secuencia de ADN activadora aguas arriba de Gal4 (UAS) se coloca aguas arriba del gen luc mientras que los diferentes activadores o las diferentes variantes/fragmentos del mismo activador se fusionan al módulo de unión al ADN GAL4 a nivel de proteína. De esta manera, la actividad transcripcional de las diferentes proteínas de fusión GAL4 se puede comparar directamente utilizando la luz como lectura. [9]
La aequorina es una fotoproteína aislada de la medusa bioluminiscente Aequorea victoria . Al añadirle iones de calcio (Ca2+) y coelenterazina, se produce una reacción cuyo resultado es la generación de luz azul en el rango de 460 a 470 nm. La aequorina se ha incorporado a líneas de células B humanas para la detección de bacterias y virus patógenos en lo que se conoce como ensayo Cell CANARY (Cellular Analysis and Notification of Antigen Risks and Yields). [10] Las células B están modificadas genéticamente para producir aequorina. Al exponerse a antígenos de diferentes patógenos, las células B recombinantes emiten luz como resultado de la activación de una cascada de señalización intracelular que libera iones de calcio dentro de la célula.
La proteína fluorescente verde (GFP) también es una fotoproteína aislada y clonada de la medusa Aequorea victoria . [11] También se han aislado variantes de la planta del mar Renilla reniformis . La GFP, al igual que la aequorina, produce una señal fluorescente azul, pero sin la adición necesaria de un sustrato exógeno. Todo lo que se requiere es una fuente de luz ultravioleta para activar las propiedades fluorescentes de la fotoproteína. Esta capacidad de autofluorescencia hace que la GFP sea muy deseable en los ensayos de biodetección, ya que se puede utilizar en línea y en el monitor de células vivas intactas. Además, la capacidad de alterar la GFP para producir emisiones de luz además del azul (es decir, cian, rojo y amarillo) permite que se utilice como un detector de múltiples analitos. En consecuencia, la GFP se ha utilizado ampliamente en construcciones de biorreporteros dentro de huéspedes bacterianos, de levadura, de nematodos, de plantas y de mamíferos.
La uroporfirinógeno (urogen) III metiltransferasa (UMT) cataliza una reacción que produce dos productos fluorescentes que producen una fluorescencia rojo-anaranjada en el rango de 590 a 770 nm cuando se iluminan con luz ultravioleta . [12] Por lo tanto, al igual que con GFP, no se requiere la adición de sustratos exógenos. La UMT se ha utilizado como un biorreportero para la selección de plásmidos recombinantes , como un marcador para la transcripción genética en células bacterianas, de levadura y de mamíferos, y para la detección de sales tóxicas como arsenito y antimonito .